Mononuclear Cell Isolation from Mouse Brain: A Density Gradient Centrifugation Technique to Isolate Brain Resident Mononuclear Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 4:11 min • April 30th, 2023
Mononuclear cells in the brain, comprising lymphocytes and monocytes, play crucial roles in maintaining brain function and homeostasis.
To isolate these mononuclear cells, first, take a freshly harvested mouse brain perfused with saline.
Perfusion allows removal of blood and its components from the blood vessels, enabling isolation of brain-resident immune cells in the subsequent steps.
Now, rinse the brain with suitable media to remove adherent red blood cells. Follow up the rinse with mincing to acquire small tissue pieces.
Homogenize the tissue pieces to obtain a suspension of single cells and cell fragments.
To this suspension, then add chilled media and suitable density gradient medium in appropriate volumes to form a low-density gradient medium.
Next, add a specific volume of a high-density gradient medium; the high-density gradient media forms a separate layer at the bottom, creating a discontinuous density gradient.
Centrifuge the suspension at high speed and low temperature conditions. Mononuclear cells occupy the interface between the two density gradient media layers.
Discard the top layer containing cellular debris and myelin - the fatty tissue sheath surrounding the nerve cell axons.
Transfer the interface layer into a fresh tube containing a suitable media and centrifuge.
Purified mononuclear cells sediment as pellet and can be resuspended in buffer for further analysis.
Cut the cranium carefully from the nose to the neck and transfer the brain of each animal from the cranial box into individual 50-milliliter tubes containing 10 milliliters of RPMI medium.
Mix the tubes well to remove the adherent red blood cells and remove the medium by aspiration. Add 10 milliliters of fresh medium to each tube and transfer the brains into individual 100-millimeter dishes.
Finely chop each brain with a razor and use a plastic pipette to transfer as much tissue from one dish at a time in 6 milliliters of medium into an ice-cold 7-milliliter sintered glass homogenizer.
Grind the brain using the "loose" plunger of the pestle before using the "tight" plunger to bring the tissue until the suspension is homogeneous. Then, pour the resulting tissue slurry into a prechilled 15-milliliter conical tube on ice.
When all the samples have been homogenized, adjust the volume in each tube to 7 milliliters with fresh medium before adding each tissue suspension to a new chilled 15-milliliter tube containing 3 milliliters of 100% basement membrane matrix per tube.
Mix by inversion a few times and use a 3-milliliter pipette to carefully and slowly add 1 milliliter of 70% density gradient solution under each tissue solution sample.
Separate the cells by density gradient centrifugation and remove almost all of the top layer, taking care to completely remove all of the myelin.
Transfer the interface into a new 15-milliliter tube and adjust the volume to 10 milliliters with fresh medium. Then, centrifuge the samples again and remove the supernatant before resuspending the pellets in about 100 microliters of medium per tube.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail de isolatie van mononucleaire cellen uit hersenweefsel van muizen, met bijzondere nadruk op hun rol in de hersenfunctie en homeostase. De methodologie omvat perfusie, weefselhomogenisatie en dichtheidsgradiëntcentrifugatie om deze immuuncellen te zuiveren voor verdere analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Mononucleaire cellen omvatten lymfocyten en monocyten.
- Deze cellen zijn essentieel voor het behoud van de gezondheid van de hersenen.
- Isolatietechnieken zijn cruciaal voor het bestuderen van hun functies.
- Het begrijpen van deze cellen kan inzicht bieden in neurologische ziekten.
Doel van de studie
- Om mononucleaire cellen uit muizenhersenen te isoleren en te zuiveren.
- Om verdere analyse van immuuncellen in de hersenen te faciliteren.
- Om methodologieën voor het bestuderen van de hersenimmunologie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Perfusie van muizenhersenen met zoutoplossing om bloed te verwijderen.
- Spoelen en fijn snijden van hersenweefsel ter voorbereiding op homogenisatie.
- Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om mononucleaire cellen te scheiden.
- Voorzichtige behandeling van weefsel om contaminatie met myeline te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van mononucleaire cellen uit hersenweefsel.
- Opstelling van een betrouwbaar protocol voor celzuivering.
- Demonstratie van het belang van dichtheidsgradiënttechnieken.
Conclusies
- Mononucleaire cellen kunnen effectief worden geïsoleerd voor onderzoek.
- De beschreven methoden verbeteren de studie van de hersenimmunologie.
- Verder onderzoek kan de rollen van deze cellen bij gezondheid en ziekte verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het isoleren van mononucleaire cellen uit de hersenen maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij de validatie van neuro-immunologische targets door een gezuiverd systeem te bieden om de functies van lymfocyten en monocyten in de homeostase van het CZS en in ziektemodellen te onderzoeken. Deze techniek ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door reproduceerbare, kwantitatieve celsuspensies te leveren voor downstream functionele assays, waardoor biologische ruis door perifere contaminanten wordt verminderd. Het sluit aan bij de ontwikkeling van preklinische modellen, waarbij inzicht in de infiltratie van immuuncellen in het CZS bijdraagt aan risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van programma's voor neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot immuuncellen in het centrale zenuwstelsel te onderzoeken in modellen voor auto-immuunziekten en neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde methode om lymfocyten en monocyten uit hersenweefsel te isoleren voor functionele doelwitvalidatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door analyse mogelijk te maken van celspecifieke reacties op immunomodulerende verbindingen in een ziekte-relevant systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverde suspensies van mononucleaire cellen die geschikt zijn voor flowcytometrie, cytokinenprofilering en fagocytose-assays.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie van de assay door myeline en debris te verwijderen die downstream read-outs beïnvloeden.
- Schaalbaarheid: Maakt de bereiding van consistente biologische monsters mogelijk voor high-content screening van immunomodulatoren in neuro-inflammatoire contexten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Geïsoleerde cellen dienen als een ziekterelevant systeem om biomarkers van immuunactivatie in het CZS te valideren die zijn waargenomen in EAE- en MS-modellen.
- Preklinische Afstemming: Ondersteunt longitudinale studies naar infiltratie van immuuncellen en fenotypische verschuivingen tijdens ziekteprogressie en behandeling.
- Risicogebaseerde Beslissingen: Maakt evaluatie van target-engagement en off-target immuuneffecten in het CZS mogelijk, wat bijdraagt aan de go/no-go-criteria in neuroimmunologische pipelines.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische profilering, waarbij geïsoleerde mononucleaire cellen uit de hersenen dienen als primaire readout voor de immunomodulerende activiteit in neuroinflammatoire ziektemodellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot het transport, de activatie en de functie van lymfocyten en monocyten in het parenchym van het CZS.
- Screening: Levert reproduceerbare, debrisvrije cel-suspensies die betrouwbare compound-screening mogelijk maken in neuro-immuunassays.
- Analytics: Biedt kwantitatieve outputs zoals celopbrengst, levensvatbaarheid en fenotypeverdeling voor comparatieve analyse over verschillende experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische validatie door cellen te leveren voor ex vivo stimulatiestudies die in vivo immuunresponsen in ziektemodellen spiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor neuro-immunologieprojecten die een consistente preparatie van immuuncellen uit het CZS vereisen voor meerdere targets en indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie door verstorende signalen van perifere bloedcellen en myelinerestanten te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare preparaten van mononucleaire cellen die geschikt zijn voor assay-overdracht tussen meerdere locaties en voor longitudinale studies.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door mechanische risicoreductie van op het CZS gerichte immunomodulatoren via directe profilering van immuuncellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van neuro-immunologische kandidaten door vroegtijdig inzicht te bieden in CZS-specifieke immuunmodulatie en veiligheidsmarges.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie en aseptische weefselverwerking om levensvatbare, contaminatievrije hersenhomogenaten te garanderen.
- Is afhankelijk van toegang tot gekoelde centrifuges en compatibele dichtheidsgradiëntmedia (bijv. Percoll of vergelijkbaar) voor een effectieve scheiding van mononucleaire cellen.
- Vereist standaardisatie van de perfusie-, hak- en homogenisatiestappen tussen verschillende operators om variabiliteit in celopbrengst en zuiverheid te minimaliseren.
- Omvat optimalisatie-overwegingen bij aanpassing aan verschillende muizenstammen, leeftijden of ziektestadia die de dichtheid van het hersenweefsel en het myelinegehalte beïnvloeden.
- Wordt beperkt door weefseltoegankelijkheid en verwerkingstijd, waarbij een snelle uitvoering na excisie noodzakelijk is om celoppervlakte-epitopen en functionele integriteit voor downstream-assays te behouden.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Lamina Propria Mononuclear Cell Isolation: A Silica-based Density Gradient Centrifugation Technique to Obtain Mononuclear Cells from Murine Colon
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026