Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 4:07 min • July 8th, 2025
Droplet digital polymerase chain reaction or dPCR technology partitions reactants of a single PCR reaction into millions of nanodroplet PCR reactions. This mass partitioning followed by amplification detects a minute amount of mutant DNA against a large background of wild-type DNA, enabling early cancer detection.
To begin, aspirate dPCR master mix containing fluorescently labeled oligonucleotides along with other PCR reagents and a droplet stabilizing oil. Add this master mix directly into the bottom of each well in a PCR strip tube to avoid air bubbles. Next, add DNA samples to the reaction mixture and pipette multiple times to mix.
Now, transfer the entire reaction mixture into a specialized chip of a droplet-generating instrument. Mount a fresh PCR strip tube onto the droplet-generating instrument. The droplet generator combines the sample and oil to form discrete nanodroplets with an encapsulated area that prevents cross-contamination between the droplets.
Once dropletization is complete, transfer the PCR strip tube to a thermal cycler to amplify the target DNA. Subsequently, load the PCR product into a droplet reader containing a fluorescence detector, which counts the fluorescent positive and negative droplets. The number of positive droplets can be used to calculate the target DNA concentration in the sample.
Before beginning the droplet digital PCR procedure, clean the bench space and equipment with 10% bleach and 70% ethanol and gently vortex and briefly centrifuge all of the reagents except the droplet-stabilizing oil. Confirm that the compressed nitrogen gas cylinder is attached to the droplet-generating instrument and that the cylinder tank is set at 90 pounds per square inch. Add 38 microliters of digital PCR reaction mixture directly into the bottom of each well of an 8-well PCR tube strip removing any bubbles with a clean pipette tip.
Add 12 microliters of pre-amplified DNA sample in triplicate to the appropriate wells of the tube strip. Gently pipette the full volume 10 times to mix the reaction mixture with the DNA sample and pipette the full volume from each well into the corresponding A through H channels of a droplet-generating instrument chip. Insert a new PCR tube strip into the droplet-generating instrument and scan the droplet-generating instrument chip ID into the software on the instrument computer.
Then, click "Start the run" to begin dropletizing samples. When the dropletization is complete, remove the PCR tube strip and apply tube strip caps. Transfer the tube strip to a thermal cycler and balance the tube with another tube strip containing 80 microliters of water per well. Then, run the thermal cycler under the appropriate thermal cycling conditions. Replace the strip caps with high-speed caps.
When the thermal cycling is complete, transfer the tube strip to the quantification instrument. Click "Setup a run" on the instrument software and place the tube strip into the quantification instrument. Place the metal shield on top of a new quantification instrument chip. Scan the chip ID into the instrument and insert the chip into the machine. Close the lid of the instrument. In the computer software, enter a name for the digital PCR run and for each of the eight channels. Then, select "Fast mode" and click "Start" to begin the quantification.
Overzicht
Dit artikel bespreekt de toepassing van droplet digital polymerase chain reaction (dPCR) technologie voor het detecteren van mutant DNA in de kankerdiagnostiek. De methode houdt in dat een enkele PCR-reactie wordt verdeeld in miljoenen nanodruppels, waardoor amplificatie en kwantificatie van het doel-DNA mogelijk worden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biotechnologie
- Genomica
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- dPCR maakt de detectie van DNA-mutaties met een lage abundantie mogelijk.
- De technologie verhoogt de sensitiviteit in vergelijking met traditionele PCR-methoden.
- Het is bijzonder nuttig bij vroege kankerdetectie.
- Druppelvorming minimaliseert het risico op kruiscontaminatie.
Doel van de studie
- Om de procedure voor het uitvoeren van dPCR te demonstreren.
- Om de voordelen van dPCR bij cancerdiagnostiek te belichten.
- Om een gedetailleerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van de dPCR-mastermix met fluorescente oligonucleotiden.
- Gebruik van een instrument voor druppelgeneratie om nanodruppels te creëren.
- Thermische cycli voor het amplificeren van het doel-DNA.
- Kwantificatie van PCR-producten met behulp van een fluorescentiedetector.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle partitionering van PCR-reacties in nanodruppels.
- Nauwkeurige kwantificering van mutant DNA-concentraties.
- Demonstratie van de sensitiviteit en specificiteit van de methode.
- Validatie van het protocol voor reproduceerbaarheid in onderzoeksettings.
Conclusies
- dPCR is een krachtig instrument voor de vroege detectie van kanker.
- De methode maakt een nauwkeurige kwantificering van mutaties met een lage abundantie mogelijk.
- Gestandardiseerde protocollen kunnen de reproduceerbaarheid van onderzoek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Droplet digital PCR (dPCR) maakt een nauwkeurige kwantificering van zeldzame tumormutaties in circulerend DNA mogelijk, wat vroege kankerdetectie en monitoring van minimale residuele ziekte ondersteunt. De technologie verdeelt PCR-reacties in miljoenen nanodruppeltjes, waardoor sensitieve detectie van mutante allelen tegen een hoge wildtype-achtergrond mogelijk is. Deze mogelijkheid verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie bij het ontdekken van oncologische geneesmiddelen door kwantitatieve, reproduceerbare metingen van genetische veranderingen met een lage abundantie te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door zeldzame mutante DNA-varianten in preklinische modellen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie via allelspecifieke detectie in complexe nucleïnezuurachtergronden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door kwantitatieve biomarkergegevens te leveren voor de bevestiging van het werkingsmechanisme.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare nanodruppelreacties voor betrouwbare screening van verbindingen tegen genetische targets.
- Kwantitatieve output: Levert absolute kwantificering van target DNA zonder afhankelijkheid van standaardcurves, wat vergelijkbaarheid tussen verschillende assays mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de gereedheid voor high-throughput screening via gecompartimenteerde reacties die de variabiliteit tussen wells minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door longitudinale monitoring van tumorgeassocieerd DNA in biofluïda mogelijk te maken.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in studies naar target engagement door nauwkeurige meting van de effecten van pathway-modulatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door biomarker-responsdrempels in ziekterelevante systemen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
dPCR past binnen het continuüm van oncologische ontdekkingen, van targetvalidatie via lead-optimalisatie tot de selectie van preklinische kandidaten, waarbij in elke fase kwantitatieve metingen van nucleïnezuren worden geleverd.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door zeldzame genetische veranderingen in celvrij DNA-monsters te detecteren en te kwantificeren.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de frequentie van mutante allelen.
- Analytics: Genereert digitale uitslagen (positieve/negatieve druppeltellingen) die absolute kwantificatie en statistische vergelijking tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische validatie via longitudinale monitoring van circulerend tumor-DNA in ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar kwantificatieplatform dat toepasbaar is op meerdere targets en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door gevoelige detectie van mutaties met een lage abundantie.
- Operationele waarde: Standardisatie en reproduceerbaarheid via gecompartimenteerde reacties die technische variabiliteit verminderen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door kwantitatieve biomarkerdrempels, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van meetbare targetmodulatie in preklinische systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met nucleïnezuren en de uitvoering van de digitale PCR-workflow.
- Afhankelijk van druppelgenererende instrumenten, thermocyclers en fluorescentiedetectiesystemen.
- Maakt standaardisatie van monstervoorbereidings- en kwaliteitscontroleprocedures tussen teams noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan diverse monstertypen, waaronder plasma, serum en cellysaten.
- Beperkt door de kwaliteit en hoeveelheid van het input-DNA, wat de partitioneringsefficiëntie en de nauwkeurigheid van de kwantificering beïnvloedt.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multiplex Droplet Polymerase Chain Reaction to Detect DNA Methylation in Leukocytes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026