In Vitro Phagocytosis Assay: A Live Imaging Based Method to Study Real-time Astrocyte Mediated Synaptosome Phagocytosis
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:33 min • July 8th, 2025
Synaptosomes are isolated neuronal fractions rich in synaptic vesicles. These synaptosomes are engulfed by astrocytes - a population of immune cells in the brain - by a process known as phagocytosis.
To study astrocyte-mediated phagocytosis in vitro, begin by taking a culture plate containing a monolayer of astrocytes. Now, add pH-indicator conjugated synaptosome suspension to the plate. This indicator dye has the property to fluoresce exclusively at a low pH. Incubate the plate for the desired duration.
During incubation, phosphatidylserine or PS present on the outer membrane of the synaptosome allows it to bind to the corresponding PS receptors on the astrocyte membrane. This facilitates the settlement of synaptosomes at the base. Aspirate the spent media along with unbound synaptosomes from the plate.
Next, supplement the plate with phagocytosis-promoting factors and incubate. Subsequently, image the plate using a fluorescence microscope. Upon binding to surface, astrocytes engulf the synaptosomes causing them to enter the phagosomes. Once inside the phagosomes, the low pH causes the indicator dye molecules to fluoresce brightly.
Real-time imaging reveals the presence of bright fluorescent spots corresponding to the pH indicator conjugated synaptosomes engulfed by the astrocytes. Eventually, these spots disappear, indicating successful degradation of synaptosomes.
For live imaging of the synaptosome engulfment, first, remove the supernatant from each well of a confluent astrocyte culture and quickly wash the cells three times with 1 milliliter of DPBS per wash. After the last wash, add 300 microliters of immunopanned astrocyte basic medium and 5 microliters of the pH indicator-conjugated synaptosomes, as well as any additional factors that can modulate glial cell phagocytosis.
Allow the synaptosomes to settle to the bottoms of the wells and to attach to phosphatidylserine receptors on the astrocytes at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide. After 40 minutes, discard the supernatants and quickly but gently wash the wells three times with 1 milliliter of DPBS per wash.
After the last wash, add 500 microliters of fresh medium supplemented with the factors of interest to the appropriate wells and transfer the plate to a live imaging instrument. Select the imaging positions, adjust the focus, exposure time, brightness, and LED power, and set the image format, time interval, and total number of cycles for live imaging as experimentally appropriate. Then, begin live imaging the phagocytosis experiments.
Overzicht
Deze studie onderzoekt het proces van astrocyten-gemedieerde fagocytose van synaptosomen, neuronale fracties die rijk zijn aan synaptische blaasjes. De methodologie maakt gebruik van een synaptosomensuspensie geconjugeerd aan een pH-indicator om het opnameproces door astrocyten in vitro te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Astrocyten spelen een cruciale rol in de immuunrespons van de hersenen.
- Fagocytose is een proces waarbij cellen cellulair debris omsluiten en verteren.
- Synaptosomen zijn belangrijk voor het bestuderen van synaptische functie en degradatie.
- Fluorescente indicatoren kunnen helpen bij het visualiseren van cellulaire processen in real-time.
Doel van de studie
- Om het mechanisme van astrocyten-gemedieerde fagocytose van synaptosomen te onderzoeken.
- Om fluorescentiemicroscopie te gebruiken voor real-time imaging van het proces.
- Om de rol van fosfatidylserine bij de binding van synaptosomen te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Kweek van astrocytten in een monolaag op een kweekplaat.
- Toevoeging van een suspensie van synaptosomen geconjugeerd aan een pH-indicator.
- Incubatie met factoren die fagocytose bevorderen.
- Fluorescentiemicroscopie voor real-time beeldvorming van fagocytose.
Belangrijkste resultaten
- Astrocyten hebben synaptosomen succesvol opgenomen, wat werd aangetoond door fluorescentie.
- Fluorescerende vlekken correspondeerden met opgenomen synaptosomen binnen fagosomen.
- Het verdwijnen van fluorescerende vlekken wees op de degradatie van synaptosomen.
- Live imaging maakte dynamische observatie van het fagocytoseproces mogelijk.
Conclusies
- De studie biedt inzicht in de functie van astrocyten bij het onderhoud van synapsen.
- Fluorescentie-imaging is effectief voor het bestuderen van fagocytose in vitro.
- Fosfatidylserine speelt een sleutelrol in het bindings- en insluitingsproces.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze assay maakt real-time kwantificatie mogelijk van astrocyten-gemedieerde fagocytose, een sleutelmechanisme bij synaptische pruning en neuroinflammatie. Het biedt een live-imaging readout voor het screenen van verbindingen die de fagocytische activiteit van glia moduleren, wat bijdraagt aan target-validatie in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. De methode levert kwantitatieve, dynamische gegevens om hypothesen in een vroeg stadium over interacties tussen het immuunsysteem en de hersenen te staven.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de functie van astrocyten in synaptische klaringstrajecten.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van targets die fagocytose moduleren in een gecontroleerd in vitro-systeem.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door target-engagement te koppelen aan meetbare fagocytische activiteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve fluorescentiemetingen voor compound-screening in 96-well formaat.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde was- en incubatiestappen zorgen voor consistente baselinemetingen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met live-imaging platforms voor medium-throughput screening van gliale modulatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Modelleert astrocyten-gestuurd synaptisch verlies dat relevant is voor de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro targetmodulatie en preklinische fenotypische resultaten in synaptische integriteit.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt go/no-go-criteria mogelijk op basis van dosisafhankelijke veranderingen in de fagocytische flux.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hitvalidatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor neuro-immuunmodulerende verbindingen.
- Discovery Biology: Test target-afhankelijke modulatie van astrocytenfagocytose als fenotypische read-out.
- Screening: Levert real-time, kwantitatieve beeldvormingsgegevens voor hit-bevestiging en SAR-progressie.
- Analytics: Fluorescerende spot-intensiteit en vervalkinetiek bieden meetbare eindpunten voor de fagocytose-snelheid en degradatie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt gliale target-modulatie met synaptisch behoud, ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde vooruitgang.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van diverse verbindingenbibliotheken tegen gliale fenotypen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de gliale-neuronale interactie, waardoor ambiguïteit in de targetfunctie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van fagocytose via pH-gevoelige fluorescentie, waardoor variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie te koppelen aan functionele fagocytische output.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gliaal-gemedieerde synaptische remodellering.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in primaire gliale kweek en live-cell fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot kamers met omgevingsbeheersing en time-lapse imaging-systemen.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van reagentia, in het bijzonder pH-indicator-geconjugeerde synaptosomen.
- Moet rekening houden met donorvariabiliteit in primaire astrocytenpreparaten over verschillende experimenten heen.
- Beperkt tot fagocytische gebeurtenissen die via fluorescentie oplosbaar zijn; niet-zure fagosomale rijping kan aanvullende probes vereisen.
Veelgestelde vragen over biofarma
Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Live-cell Phagocytosis Assay of Microglia-Like Cells Using Human Synaptosomes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026