Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie
15 augustus 2011
Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.
Het algemene doel van deze procedure is om efficiënte gentransfectie te verkrijgen in het centrale zenuwstelsel van het embryonale muizenmodel op een gewenst ontwikkelingsmoment en in een specifiek hersengebied. Dit wordt eerst bereikt door precisiecapillairen en naaldvormige elektroden voor te bereiden om beschadiging van de baarmoeder te voorkomen. De tweede stap van de procedure is het aanleren van een unieke methode om embryo's vast te houden met behulp van een glasvezelkabel om kleine embryo's te visualiseren voor gerichte DNA-injectie.
De derde stap van de procedure is het uitvoeren van electroporatie met elektroden van het stick-type op het oppervlak van de uterus om DNA te transfecteren in oppervlakkige delen van de hersenen; de laatste stap van de procedure is het uitvoeren van electroporatie met elektroden van het naald-type in dieper gelegen structuren van de hersenen, zoals de thalamus en hypothalamus. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die corticale laagspecifieke transfectie of efficiënte transfectie in de thalamus aantonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals reguliere in utero electroporatie, is de grotere zichtbaarheid en controle over de locatie van de electroporatie van embryo's in de uterus.
We maken gebruik van een glasvezelkabel, waarmee het mogelijk is om embryo's vanaf E 9.5 te visualiseren en naalden te gebruiken om plasmide-DNA over te dragen naar diepere delen van de hersenen, zoals de thalamus en hypothalamus. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ontwikkeling van de hersenen, zoals neuronale differentiatie, hersenpatroonvorming en neurale connectiviteit. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het lastig is om de naald en elektrode te vormen en de juiste positie te bepalen.
De uterus en embryo's. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om te zien hoe precieze naaldelektroden worden gemaakt en hoe embryo's worden gepositioneerd voor elektroporatie. Aangezien deze twee stappen essentieel zijn voor succesvolle resultaten. Gebruik voor het prepareren van capillairen een micropipetpuller volgens de instructies van de fabrikant.
In deze procedure gebruiken we glazen capillaire buisjes van één millimeter zonder interne vezel. Uitgetrokken naalden moeten, gemeten met een dissectiemicroscoop, een lengte van 800 µm tot 1 mm vanaf de punt hebben met een buitendiameter van minder dan 60 µm; gebruik een pincet om de naaldpunten af te knijpen tot een diameter van 20 tot 30 µm. Meet elke naald na met een micrometer.
Bereid vervolgens micro-elektroden voor door middel van wikkelen. Wikkel één uiteinde van een wolfraamdraad rond een vergulde pin. Gebruik wolfraamdraad voor negatieve elektroden en platina-draad voor positieve elektroden.
Bevestig de draad met param aan de pin. Steek de draad vervolgens in de plastic steel van een wattenstaafje en wikkel beide uiteinden gelijkmatig in phim. Slijp de punt van de draad gelijkmatig met fijn schuurpapier totdat deze een dikte van 20 tot 30 µm bij de punt bereikt en 60 µm op een afstand van 800 µm tot 1 mm vanaf de punt. Controleer de uiteindelijke afmetingen opnieuw met een micrometer.
Dompel vervolgens de geslepen draad in een druppel nagellak om de gehele draad te voorzien van een dunne isolerende laag. Nadat de nagellak is opgedroogd, wordt een wattenstaafje gedrenkt in aceton gebruikt om de lak van de laatste 200 micrometers van de punt te verwijderen. Platina-elektroden worden kant-en-klaar gekocht en vereisen geen voorbereiding.
In deze procedure gebruiken we de CUY six 10 P four dash one nepo gen-elektrode. Purificeer plasma-DNA met een maxi-prep of een gelijkwaardige methode, breng 100 µg DNA over naar een nieuwe buis en voeg 10 µL 1% fast green-kleurstof toe. Gebruik TE om het volume aan te vullen tot 100 µL voor een uiteindelijke plasma-DNA-concentratie van 1 µg/µL. Meng de oplossing voorzichtig door te pipetteren en centrifugeer vervolgens de DNA-oplossing gedurende vijf minuten bij 14.000 RPM op kamertemperatuur om onzuiverheden en zouten te verwijderen.
Overbreng de SNAT naar een nieuwe buis. De DNA-oplossing kan tijdens de gehele procedure bij kamertemperatuur in de buis bewaard worden. Sluit vervolgens een getrokken naald aan op een micromanipulator volgens de instructies van de fabrikant en dompel de punt van de naald in de DNA-oplossing om de naald te vullen.
Zet de micromanipulator voorzichtig opzij en bereid de chirurgische ingreep voor. Weeg een drachtige muis op embryonale dag 9,5 tot 15,5 om het lichaamsgewicht te bepalen.
Injecteer vervolgens farmaceutische natriumpentobarbital intraperitoneaal in een dosering van 50 microgram per gram lichaamsgewicht en wacht vijf minuten. Alternatieven voor natriumpentobarbital kunnen ketamine, xylazine, injectie- of gasanesthetica zijn.
Scheer na het verdoven de haren van de buik weg met een scheermesje en 50% ethanol. Bereid de huid voor door afwisselend te scrubben met Betadine en 70% alcohol. Maak met een fijne schaar een incisie in de middellijn van de buik.
Trek alle uterine hoorns voorzichtig uit naar een met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS bevochtigd katoengasje dat rond de wond is geplaatst. Houd de uterus gedurende de gehele procedure vochtig met PBS. Gebruik hiervoor een flexibele optische vezelkabel.
Plaats de kabel onder de uterine horn. Positioneer de uterus tussen het glasvezellicht en de duim en knijp voorzichtig om het embryo omhoog te duwen, dichter naar de baarmoederwand. Wanneer het embryo zo is gepositioneerd dat de kop naar links is gericht en omhoog kijkt, wordt de glazen capillair voorzichtig in het doelventricikel ingebracht en wordt ongeveer 1 µL DNA-oplossing geïnjecteerd voor electroporatie van corticale laag vier op embryonale dag 13.5.
Plaats de platina staafelektroden buiten de uterus en dien vijf keer vierkantgolfpulsen toe van 38 volt gedurende 50 milliseconden. Indien micro-elektroporatie wordt gebruikt om de thalamus of hypothalamus te bereiken op embryonale dag 10,5, voer dan de fijne wolfraam negatieve elektrode in het DNA-geïnjecteerde ventrikel in en de platina positieve elektrode in de uterus. Positioneer het doelgebied tussen de uiteinden van beide elektroden en dien de voorgestelde vierkantgolfpulsen drie keer toe bij zeven volt gedurende 100 milliseconden.
Nadat de elektroporatie is voltooid, plaatst u de uterinehoorn terug op de oorspronkelijke locatie en voegt u 500 µL PBS toe. Hecht de binnenste laag van de incisie met een chirurgische hechtnaald. Sluit vervolgens de buitenste laag met een auto-clip van negen millimeter.
Plaats de muis gedurende twee uur op een warmtepad om herstel van de chirurgische ingreep en de anesthesie mogelijk te maken. Hier wordt de platinuim-elektroporatie van de corticale regio getoond, toegepast op embryonale dagen 13,5, 14,5 en 15,5. De hersenen werden postnataal geoogst.
Dag zes. De laag geëlektroporeerde corticale cellen is in elk experiment duidelijk verschillend. Dit suggereert dat tijdsafhankelijke elektroporatie het mogelijk maakt om specifieke gain-of-function en loss-of-function in corticale lagen te realiseren.
Hier wordt electroporatie in diep weefsel, zoals de thalamus en hypothalamus, getoond. Het gebruik van platina staafelektroden resulteert vaak in een lage efficiëntie; het gebruik van micro-elektroden voor electroporatie biedt in deze diepe weefsels een betere efficiëntie en levensvatbaarheid.
We hebben een plasma-DNA-oplossing geïnjecteerd in de derde ventrikel van muisembryo's. Op embryonale dag 11,5 hebben we naaldelektroporatie toegepast die beperkt was tot de thalamus; het grootste deel van de thalamus-axonen projecteert tegen postnatale dag zes naar de cortex. Hier tonen we P-C-A-G-E-Y-F-P micro-elektroporatie in het ontwikkelende cephalon.
Het gebied van de thalamus wordt aangetoond door RORC, dat alle post-mitotische thalamische neuronen labelt. Axonprojecties naar laag vier van de cortex, aangegeven met witte pijlen, kunnen ook worden gevisualiseerd door EYFP, dat het gehele neuron vult. De positie van laag vier in de cortex wordt eveneens gelabeld door het RORC-antilichaam.
Zodra MA start, kan deze techniek in 15 minuten per liter worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de test zeer voorzichtig te hanteren om beschadiging tijdens deze procedure te voorkomen. Andere methoden, zoals het inbouwen van een specifiek chromo in MDNA, kunnen worden uitgevoerd om het moleculaire mechanisme van cel-specificatie na de ontwikkeling te begrijpen.
Deze techniek biedt onderzoekers in het veld van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen bij patroonvorming, axonale groei en circuitvorming te onderzoeken.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor gentransfer in de zich ontwikkelende muizenhersenen met behulp van een unieke chirurgische techniek en gespecialiseerde elektroden. Deze aanpak maakt een precieze transfectie van plasmide-DNA mogelijk, wat onderzoek naar de ontwikkeling van de hersenen faciliteert.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genoverdrachtstechnieken
- Embryonale ontwikkeling
Achtergrond
- De procedure is gericht op een efficiënte gentransfectie in het centrale zenuwstelsel van het embryonale muismodel.
- Er wordt gebruikgemaakt van precisiecapillairen en naaldvormige elektroden om beschadiging van de baarmoeder te minimaliseren.
- De methode omvat een unieke techniek voor het vasthouden van embryo's met behulp van glasvezelvisualisatie.
- Er wordt electroporatie uitgevoerd om DNA in specifieke hersengebieden te transfecteren.
Doel van de studie
- Om gerichte gentransfectie te bewerkstelligen tijdens specifieke ontwikkelingsstadia.
- Om de zichtbaarheid en controle tijdens het injectieproces te verbeteren.
- Om kernvragen over neuronale differentiatie en hersenconnectiviteit te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van precisiecapillairen en elektroden voor DNA-injectie.
- Gebruik van glasvezelkabels voor visualisatie van embryo's.
- Elektroporatietechnieken voor het transfecteren van DNA in diverse hersengebieden.
- Gedetailleerde chirurgische procedures voor de hantering van embryo's en de aflevering van DNA.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie waargenomen in corticale lagen en dieper gelegen hersenstructuren.
- Aangetoonde grotere controle over de transfectieplaats in vergelijking met traditionele methoden.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van processen bij de hersenontwikkeling.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor gentransfectie in embryonale muizen.
- Het biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van zichtbaarheid en precisie voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten om diverse aspecten van de hersenontwikkeling te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
In utero electroporatie maakt functionele analyse van kandidaatgenen in een vroeg stadium in de hersenen in ontwikkeling mogelijk, wat doelwitvalidatie ondersteunt voorafgaand aan de generatie van transgene modellen. Deze aanpak vermindert de afhankelijkheid van CRE-lijnen, vergroot de toegankelijkheid tot regio's zoals de thalamus en hypothalamus, en versnelt het mechanistische risicobeheer bij de ontdekking van neurodevelopmentale doelwitten. Door ruimtelijk en temporeel gecontroleerde transfectie te bieden, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid bij het testen van vroege doelwithypotheses.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele toetsing van signalerings- en axongeleidingsgenen in specifieke embryonale hersengebieden mogelijk om therapeutische hypothesen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een snel, kosteneffectief alternatief voor CRE-afhankelijke knock-in/knock-outmodellen voor vroege onderzoeking van targets.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt gain- en loss-of-functionstudies in gebieden waar regionaal specifieke CRE-lijnen ontbreken, waardoor het vertrouwen in de target toeneemt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief beoordeelbare transfectiepatronen in corticale lagen en diepe hersenstructuren voor screening op basis van fenotypes.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde elektrodevoorbereiding en DNA-afgifte om de reproduceerbaarheid tussen experimenten te verbeteren.
- Schaalbaarheid: Maakt herhaaldelijk gebruik mogelijk van glasvezelvisualisatie en capillaire toegang tot de baarmoeder voor een consistente behandeling van embryo's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Faciliteert de studie naar neuronale differentiatie, hersenpatronering en neurale connectiviteit van vroege embryogenese tot postnatale analyse.
- Mechanische risicoreductie: Maakt onderzoek naar genfunctie in diepe hersenstructuren zoals de thalamus en hypothalamus mogelijk, wat relevant is voor modellen van neuro-ontwikkelingsstoornissen.
- Predictieve betrouwbaarheid: Tijdsonafhankelijke electroporatie maakt laagspecifieke transfectie mogelijk, wat modellering van dosis- en tijdrespons ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door hypothese-gestuurde genmodulatie in embryonale hersenregio's mogelijk te maken, wat bijdraagt aan lead-identificatie en de selectie van preklinische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door gerichte transfectie van kandidaatgenen in ventriculaire zones en diepe hersenstructuren.
- Screening: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste transfectieresultaten die vergelijkende conditieanalyse in fenotypische screens ondersteunen.
- Analytics: Maakt meting van transfectie-efficiëntie en corticale laagspecificiteit mogelijk via fluorescente reporters en immunokleuring.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vroege embryonale genfunctie met postnatale hersenpatronering en connectiviteitsresultaten.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor embryonale hersentransfectie over meerdere doelgenen en ontwikkelingstijdstippen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de vroege validatie van neuro-ontwikkelingstargets door middel van precieze spatiotemporele genmodulatie.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde capillaire en elektrodevoorbereiding, glasvezelvisualisatie en gecontroleerde electroporatieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele beoordeling van targets mogelijk te maken, waardoor investeringen in slecht gevalideerde kandidaten worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door functionele data te genereren in ziekterelevante embryonale systemen voorafgaand aan de resource-intensieve generatie van modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microchirurgie, de hantering van embryo's en de fabricage van elektroden met behulp van wolfraam/platina-draden en capillaire pullers.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder glasvezelkabels, micromanipulatoren en electroporatoren die in staat zijn tot nauwkeurige voltage- en pulsregeling.
- Vereist standaardisatie van de positionering van embryo's, de DNA-concentratie en de electroporatieparameters tussen gebruikers en laboratoria voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende embryonale stadia (E9.5–E15.5) en hersendoelen (corticaal versus diepere structuren zoals de thalamus/hypothalamus).
- Praktische beperkingen omvatten de technische moeilijkheid bij het vormen van naald-elektroden en het behoud van de integriteit van de baarmoeder tijdens de procedures, zoals vermeld in het protocol.
