Waarom is de inductie van dubbelstrengse breuken belangrijk voor targetvalidatie?

Het induceren van dubbelstrengs breuken via Cas9-gRNA-complexen maakt nauwkeurige gendisruptie mogelijk via non-homologe eindverbinding, wat essentieel is voor het beoordelen van de essentialiteit van targets en genetische redundantie in ziektemodellen.

Hoe draagt gRNA-isolatie bij aan de efficiëntie van de discovery-pipeline?

Het isoleren van individuele gRNA-functies binnen een concatemeer stelt onderzoekers in staat om fenotypische effecten aan specifieke genen toe te schrijven, wat bijdraagt aan een nauwkeurige risicoanalyse van targets en padanalyse.

Wat maken kwantitatieve fenotypische metingen mogelijk in multi-gen-studies?

Kwantitatieve resultaten, zoals organoïdevorming of groeisnelheden, maken een vergelijking mogelijk tussen de effecten van single versus multi-gene knockout, waardoor genetische interacties en synthetische lethaliteit kunnen worden beoordeeld.

Waarom zijn replicatievereisten belangrijk voor cross-functionele samenwerking?

Een reproduceerbare knockout-efficiëntie over verschillende experimenten heen zorgt ervoor dat gegevens die zijn gegenereerd in de discovery biology betrouwbaar kunnen worden gebruikt door screening- en preklinische teams voor de besluitvorming.

Welke statistische analyse is vereist voordat deze methode in screening wordt geïmplementeerd?

Analyse van de knockout-efficiëntie en fenotypische variantie over replica's is nodig om robuuste drempelwaarden voor de selectie van hits vast te stellen en de geschiktheid van de assay voor downstream-applicaties te garanderen.

CRISPR Concatemer-Mediated Multiple Gene Knockout: A Technique to Simultaneously Knockout Multiple Genes by Non-Homologous End-Joining Pathway in Mouse Intestinal Cells

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 4:13 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To simultaneously knock out multiple genes using the CRISPR-concatemer-Cas9 system, begin with a tube containing the mouse intestinal cell suspension. Supplement the tube with CRISPR-concatemer vectors containing the expression cassette for multiple guide RNAs, or gRNAs, integrated adjacent to each other.

Each gRNA cassette is custom-designed to individually knock out the intended gene. Add expression vectors encoding Cas9 endonuclease to the same tube. Electroporate the cell-plasmid mixture - a technique that uses electric current to facilitate the entry of plasmids into the cell. Inside the cell, the co-expression of the CRISPR-concatemer and the Cas9 vector forms gRNA sequences and Cas9 nucleases, respectively.

Each gRNA sequence binds to the corresponding Cas9 enzyme, forming multiple Cas9-gRNA complexes that attach to the target sites in the host genome. This binding activates the Cas9 enzyme, which produces a nick in both DNA strands upstream to the protospacer adjacent motif, or PAM, site. This results in a double-strand break, or DSB, in the target DNA.

In the absence of any homologous sequence to the target gene, the cell's endogenous repair mechanism, called the non-homologous end joining, is triggered, allowing the repair proteins and kinase molecules to bind at the break site. Later, the ligase enzyme repairs the DSB, resulting in modifications of the target gene sequence. These modifications disrupt the function of the genes, resulting in multiple genes knockout.

Begin this procedure by adding 9 milliliters of reduced serum medium to the 15-milliliter tube containing the cell suspension, and centrifuge at 400G for 3 minutes at room temperature. Remove all the supernatant, and resuspend the pellet in an electroporation solution. Add a total amount of 10 micrograms DNA to two new tubes. Then, add electroporation solution to a final volume of 100 microliters and keep the cell-DNA mixture on ice.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

CRISPR Concatemer-Mediated Multiple Gene Knockout: A Technique to Simultaneously Knockout Multiple Genes by Non-Homologous End-Joining Pathway in Mouse Intestinal Cells

Overzicht

Belangrijkste Onderdelen van de Studie

Wetenschappelijk gebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele impact en impact op de organisatie

Overwegingen voor implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio