Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Technieken
0 weergaven • 3:11 min • July 8th, 2025
Recombinant adeno-associated virus, rAAV, is a small, single-stranded DNA virus genetically engineered to target a specific cell type and transport its genetic cargo to the host cell nucleus for gene expression.
Begin by restraining a cryo-anesthetized mouse pup. Sterilize the back skin and subcutaneously inject the rAAV vector carrying the desired transgene along a cardiac-specific promoter. The vector gets absorbed into the vascular system and reaches distant organs, including the heart.
Here, the recombinant virus attaches to the surface of the cardiomyocyte and gets internalized via endocytosis into an endosome. Within the endosome, the viral capsid partially disassembles, exposing the viral lytic proteins. This protein induces pores in the endosomal membrane, through which the vector escapes into the cytoplasm.
The vector travels across cytoplasmic microtubules and enters through the nuclear pore. Once in the nucleus, the viral capsid disassembles to release its genome. The single-stranded DNA carrying the target gene is then converted into double-stranded DNA.
Following DNA transcription, the produced mRNA moves into the cytoplasm. Here, the mRNA undergoes translation, expressing the target protein in the cardiomyocytes. Observe tissue samples from different organs under a fluorescence microscope to determine the efficiency and tissue specificity of the gene delivery to the heart.
After determining the viral titer according to the text protocol, prepare rAAV9 working solutions with virus titers of 1-7 x 1012 particles per milliliter. To treat neonatal mice, use the rAAV9 solution to prefill a 0.33 x 12.7-milliliter insulin syringe with a 29-gauge 1/2-inch needle, avoiding air bubbles.
After cryoanesthetizing a pup, hold the pup in one hand with thumb and forefinger. Then, swipe the back skin of the pup with a swab stick saturated with 70% isopropyl alcohol. Insert the syringe needle into the anterior-dorsal subcutis of the animal at an angle of 5 to 10 degrees before injecting 50 to 70 microliters of the rAAV9 solution.
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) voor gerichte genoverdracht naar cardiomyocyten in neonatale muizen. De methodologie omvat subcutane injectie van de rAAV-vector, wat genexpressie in het hart faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Gentherapie
- Cardiovasculair onderzoek
- Virale vectortechnologie
Achtergrond
- rAAV is een klein, enkelstrengs DNA-virus dat wordt gebruikt voor genoverdracht.
- Het virus kan zodanig worden aangepast dat het zich richt op specifieke celtypen.
- Inzicht in het mechanisme van genoverdracht is cruciaal voor therapeutische toepassingen.
- Efficiënte genexpressie in cardiomyocyten kan belangrijke implicaties hebben voor de behandeling van hartaandoeningen.
Doel van de studie
- Om het proces van rAAV-gemedieerde genoverdracht naar het hart te demonstreren.
- Om de efficiëntie en specificiteit van genexpressie in cardiomyocyten te beoordelen.
- Om een protocol vast te stellen voor het gebruik van rAAV bij neonatale muizen.
Gebruikte methoden
- Preparatie van rAAV-vectoren met hartspecifieke promotoren.
- Subcutane injectie van rAAV in cryo-geanestheseerde muizenpups.
- Observatie van weefselmonsters met fluorescentiemicroscopie.
- Bepaling van de virale titer en preparatie van werkoplossingen.
Belangrijkste resultaten
- De rAAV-vector target succesvol cardiomyocyten voor genexpressie.
- Er werd een efficiënte internalisatie en nucleaire entry van de virale vector waargenomen.
- Genexpressie werd bevestigd via mRNA- en proteïneanalyse.
- Het vastgestelde protocol maakt reproduceerbare gentransfer mogelijk in neonatale muizen.
Conclusies
- rAAV is een effectief middel voor genoverdracht naar het hart.
- De studie biedt een kader voor toekomstige toepassingen van gentherapie.
- Verder onderzoek is nodig om de langetermijneffecten en het therapeutische potentieel te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) maakt gerichte aflevering van transgenen aan cardiomyocyten in neonatale knaagdiermodellen mogelijk, wat de vroege validatie van constructen voor cardiale gentherapie ondersteunt. Deze benadering biedt een reproduceerbaar systeem voor het beoordelen van de efficiëntie van transgene expressie en weefselspecificiteit, wat bijdraagt aan de selectie van targets en het mechanistisch reduceren van risico's binnen cardiovasculaire ontdekkingsprogramma's. Door een protocol voor subcutane injectie met hartspecifieke promotoren vast te stellen, ondersteunt deze methode de preklinische continuïteit van targetidentificatie tot lead-optimalisatie in onderzoek naar hartziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door transgenen af te leveren aan cardiomyocyten voor functionele beoordeling.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door expressie aangestuurd door hartspecifieke promotoren in een relevant in vivo-model.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door het verschaffen van kwantitatieve resultaten van de efficiëntie en specificiteit van de transgeenexpressie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door consistente transgene expressie in hartweefsel vast te stellen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via fluorescentiemicroscopie en mRNA-analyse om de efficiëntie van de aflevering te beoordelen.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform voor meerdere targets mogelijk met behulp van gestandaardiseerde rAAV9-werkoplossingen (1-7 x 10^12 particles/mL).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door genexpressie in het doelorgaan te bevestigen.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door weefselspecifieke expressie te verifiëren en off-target effecten te minimaliseren.
- Voorspellend vertrouwen: Biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van op het hart gerichte gentherapie-constructen voorafgaand aan IND-ondersteunende studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinisch onderzoek, waardoor iteratieve design-testcycli voor kandidaten voor cardiale gentherapie mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gecontroleerde transgene expressie in cardiomyocyten mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde virale titers en protocollen voor subcutane injectie die reproduceerbare orgaantargeting garanderen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (fluorescentie-intensiteit, mRNA-niveaus) waarmee expressiecondities kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekking met preklinische validatie door cardiac-specifieke expressie te bevestigen, een belangrijke biomarker voor target engagement.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor cardiac gene delivery dat kan worden toegepast op meerdere targets en constructen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in studies naar cardiale genexpressie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde ranges voor virale titers en injectieparameters (50-70 µL, hoek van 5-10 graden).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege signalen van werkzaamheid te verschaffen, waardoor biologische risico's in een laat stadium van cardiovasculaire programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van gentherapie-kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde leveringsefficiëntie en specificiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van neonatale muizen, cryoanesthesie en steriele subcutane injectietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopie en qPCR voor mRNA-analyse om de transgene expressie te beoordelen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bepaling van de virale titer en de bereiding van de werkoplossing (1-7 x 10^12 particles/mL).
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het wijzigen van promotoren of transgenen, terwijl de cardiale specificiteit behouden blijft.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in virale absorptie en orgaandistributie, wat empirische optimalisatie voor elk construct noodzakelijk maakt.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Productie van Adeno-geassocieerde virusvectoren in celstapels voor preklinische studies in grote diermodellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Intravenous Administration of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in a Rat Model
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vivo Genoverdracht op het konijn gemeenschappelijke halsslagader endotheel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026