Waarom is het toetsen van de nulhypothese van belang voor targetvalidatie bij robotgestuurde micro-injectie?

Het toetsen van de nulhypothese bepaalt of de waargenomen fluorescentie in geïnjecteerde neuronen significant boven de achtergrondwaarden ligt, waarmee wordt bevestigd dat de polysacharide-oplossing specifiek is afgeleverd in plaats van dat er sprake is van aspecifieke opname of autofluorescentie. Deze statistische validatie ondersteunt betrouwbare conclusies over target engagement in de vroege ontdekkingsfase.

Hoe past de isolatie van de onafhankelijke variabele in de discovery-pipeline van deze microinjectiemethode?

De methode isoleert de geïnjecteerde polysaccharide-oplossing als de onafhankelijke variabele door de naaldtrajectorie, de injectiedruk en het volume te controleren, waardoor onderzoekers de waargenomen neuronale responsen direct aan de toegediende verbinding kunnen toeschrijven. Deze isolatie maakt een duidelijke mapping van de structuur-activiteitsrelatie mogelijk bij inspanningen voor lead-identificatie.

Welke kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele maken het mogelijk om het succes van de micro-injectie te beoordelen?

Metingen van de fluorescentie-intensiteit binnen het cytoplasmatische compartiment van geïnjecteerde neuronen dienen als de primaire afhankelijke variabele om de hoeveelheid succesvol afgeleverde polysacharide-oplossing te kwantificeren. Deze metingen maken een objectieve vergelijking van de injectie-efficiëntie tussen verschillende experimentele condities en verbindingformuleringen mogelijk.

Waarom zijn replicatie-eisen van belang voor crossfunctionele samenwerking in studies naar robotische micro-injectie?

Replicatie over meerdere neuronen, coupes en experimentele runs garandeert dat het succes van de injectie en de geobserveerde fenotypes consistent zijn en niet te wijten zijn aan willekeurige variabiliteit of technische artefacten. Deze reproduceerbaarheid is essentieel voor het genereren van betrouwbare gegevens waar discovery-, preklinische en translationele teams op kunnen vertrouwen.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist voordat deze micro-injectietechniek in een discovery-workflow wordt geïmplementeerd?

Voor de implementatie is de mogelijkheid vereist om kwantitatieve fluorescentieanalyse uit te voeren, inclusief achtergrondcorrectie, segmentatie van interessegebieden en statistische vergelijking van de injectie-efficiëntie tussen controle- en experimentele groepen met behulp van t-toetsen of ANOVA. Deze analyses maken datagestuurde beslissingen mogelijk over de effectiviteit van verbindingen en de betrouwbaarheid van de targetvalidatie.

Image-Guided Robotic Cell Microinjection: An Automated High-Throughput Technique for the Precise Delivery of Fluorescently-Labeled Polysaccharides Into Single Neuronal Cells in Organotypic Brain Slice Cultures

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 5:08 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To perform robotic cell microinjection, begin by loading a chilled, fluorescently-labeled biocompatible polysaccharide solution into an optimized microinjection needle. Mount the loaded needle onto the holder of a programmable micromanipulator for precise needle positioning during microinjection.

Transfer a culture dish containing mouse embryonic organotypic brain tissue slices in media on a heated microscope stage to maintain tissue physiological conditions. Focus on the basal surface of the brain tissue slice, which comprises pyramidal neurons, and immerse the needle in media to position it close to the neurons to be microinjected.

Adjust compensation pressure to prevent media backflow into the needle via capillary action.

Using software, define the trajectory and needle angle. Position the needle at the start-point of the mapped trajectory and initiate the automated microinjection run.

The needle travels a specified distance towards the target cell. The applied force causes the needle to press against the cell membrane, which builds up local tension, and rupture the phospholipid bilayer, allowing penetration. Upon access to the cytoplasmic compartment, the needle - as per set injection pressure - dispenses a controlled volume of the loaded solution. Post-injection, the needle retracts.

The perforation in the cell membrane elicits an intrinsic cellular repair response to restore membrane homeostasis. The cell membrane reseals with minimal damage to the neurons, entrapping the fluorescently-labeled polysaccharide solution. The microinjection run continues until all cells within the trajectory are injected. Successfully injected neurons in brain tissue slices exhibit fluorescence.

Turn on the computer, microscope, microscope camera, manipulators, pressure rig, and pressure sensor. Load the application by clicking the file "launchapp.py" in the main folder downloaded from GitHub, and specify the device settings in the pop-up screen.

To prevent unwanted clogging, create an outward pressure before submerging the pipette into the solution. Slide the 'Compensation pressure' bar to 24% to 45% and click 'Set values.' Next, tune the pressure by turning the mechanical pressure valve knob to 1 to 2 PSI, as indicated by the pressure sensor. Transfer the slices to the center of a 3.5-centimeter Petri dish containing 2 milliliters of pre-warmed CIMM.

Then, place the Petri dish on the microinjection stage that has been preheated to 37 degrees Celsius. Load the microinjection pipette with 1.4 to 1.6 microliters of microinjection solution using a long-tip plastic pipette, and insert the microinjection pipette into the pipette holder.

Using the lowest magnification on the microscope, bring the slice into focus, and guide the micropipette to this field of view so that it is focused on the same plane as the slice target. Switch the output of the microscope to the camera to see the FOV and the application.

Click the magnification button in the top left of the interface to initiate device calibration. When a window prompts to select the magnification, select the '10x' and press 'OK.' The software assumes the internal objective lens is 10x. Refocus the pipette tip using the micrometric wheel of the microscope, and click the pipette tip with the cursor.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Image-Guided Robotic Cell Microinjection: An Automated High-Throughput Technique for the Precise Delivery of Fluorescently-Labeled Polysaccharides Into Single Neuronal Cells in Organotypic Brain Slice Cultures

Overzicht

Belangrijkste studieonderdelen

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste Resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline en Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Knaagdieren Brain Micro-injectie om te studeren Molecular substraten van gemotiveerd gedrag

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Single Cell Electroporation in Organotypic Brain Slice Cultures: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids Inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van In Utero Elektroporatie

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren