Waarom is het testen van de nulhypothese belangrijk voor de validatie van glycaanscheiding?

Toetsen van de nulhypothese zorgt ervoor dat waargenomen verschillen in glycaanretentietijden of piekintensiteiten statistisch significant zijn, wat bijdraagt aan een betrouwbare validatie van targets en het aantal fout-positieven bij glycaanprofilering vermindert.

Hoe past de isolatie van de onafhankelijke variabele bij HILIC-glycaananalyse?

Het isoleren van variabelen zoals de samenstelling van de mobiele fase en de stroomsnelheid stelt teams in staat om veranderingen in de glycaanscheiding direct toe te schrijven aan experimentele condities, wat de optimalisatie en reproduceerbaarheid in de ontdekkingsfase versterkt.

Wat maken kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele mogelijk in HILIC-workflows?

Kwantitatieve metingen van de fluorescentie-intensiteit en de retentietijd maken een nauwkeurige vergelijking van glycaan-soorten mogelijk, wat de ontwikkeling van robuuste assays vergemakkelijkt en datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.

Waarom zijn replicatie-eisen cruciaal voor cross-functionele glycaananalyses?

Replicatie zorgt ervoor dat de scheiding en detectie van glycanen consistent zijn over verschillende runs en teams, wat betrouwbare gegevensdeling en cross-functionele samenwerking bij de ontwikkeling van biologics mogelijk maakt.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist vóór de implementatie van HILIC?

Teams moeten statistische instrumenten toepassen om de reproduceerbaarheid van chromatogrammen, de piekresolutie en de signaal-ruisverhoudingen te beoordelen, om zo de analytische robuustheid te garanderen voordat HILIC in bredere R&D-workflows wordt geïntegreerd.

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Separate Hydrophilic Polar Analytes Using Hydrophilic Beads

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 3:07 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC, is a technique to separate hydrophilic polar compounds based on their degree of polarity. Begin by setting up a HILIC column packed with hydrophilic beads carrying polar functional groups.

First, condition the column using an equilibration buffer and mobile phase - a mixture of organic solvent and water. The buffer molecules stabilize the pH, while organic solvent saturates the column. The water molecules immobilize and create an aqueous layer over the hydrophilic beads.

Load the sample containing a mixture of glycans - hydrophilic polar compounds - labeled with a fluorescent tag. Run the sample using a mobile phase gradient through the column at an optimum flow rate.

As the sample moves along the hydrophobic mobile phase, the glycans migrate into the aqueous layer, leaving behind the impurities. Subsequently, glycans move toward the polar functional groups on the beads. Here, more polar glycans bind strongly, while less polar ones bind loosely.

As the mobile phase hydrophobicity decreases, weakly bound glycans with less polarity and a shorter retention time elute first. Conversely, strongly bound glycans with higher polarity and a longer retention time elute last.

Finally, a detector detects the fluorescent signal of the eluted fractions, corresponding to standard glycan peaks in the chromatogram.

First, open the software to control the mobile phases. Wash UPLC instruments with 50% solvent B and 50% solvent C at the flow rate of 0.2 milliliters per minute, for 30 minutes. Then wash, with 25% solvent A and 75% solvent B at a flow rate of 0.2 milliliters per minute, for 20 minutes, then, at a flow rate of 0.4 milliliters per minute.

Dissolve the labeled N-glycans with 25 microliters of a mixture of 100% acetonitrile and ultra-pure water at a 2:1 (volume/volume) ratio. Then, centrifuge at 134 x g for 5 minutes at 4 degrees Celsius, and use a drive pipe to load 10 microliters of the supernatant into the UPLC instruments.

Separate the labeled N-glycans at a flow rate of 0.4 milliliters per minute, with a linear gradient of 75% to 62% acetonitrile for 25 minutes. Then, perform an analytical run by Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column on a UPLC at 60 degrees Celsius.

Detect N-glycan fluorescence at excitation and emission wavelengths of 330 nanometers and 420 nanometers respectively.