De toepassing van permanente midden cerebrale slagader Ligatie in de muis
25 juli 2011
Midden cerebrale arterie (MCA) ligatie is een techniek om focale cerebrale ischemie studie in diermodellen. In deze methode wordt de middelste hersenslagader blootgesteld door craniotomie en geligeerd door cauterisatie. Deze methode geeft zeer reproduceerbare infarct volumes en hogere post-operatieve overlevingskansen in vergelijking met andere methoden beschikbaar.
Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van focale cerebrale ischemie in diermodellen. Dit wordt bereikt door eerst een kleine incisie in de huid te maken tussen het linker oog en de basis van het oor. Vervolgens wordt een craniotomie uitgevoerd op het kruispunt van de zygomatische boog en het squamosum om de middelste cerebrale arterie bloot te leggen, waarna de middelste cerebrale arterie wordt geligeerd met een klein vaten-cauterisator.
Ten slotte wordt de huid gehecht om de wond te sluiten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een infarct aantonen in het linkerhemisfeer van het muizenbrein. Het brein kan worden gekleurd met TTC of gescand met MRI voor de visualisatie van een beroerte.
Het door een beroerte aangetaste brein kan ook worden gebruikt voor de bepaling van de eiwit- of mRNA-expressie. Hallo, ik ben Garza Chola. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Gale Johnson aan de University of Rochester.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het vakgebied van beroertes, zoals het illustreren van de mechanismen die leiden tot celdood in het ischemische brein. Steriliseer ter voorbereiding op de chirurgie alle chirurgische instrumenten, gaasjes en cognitieve applicatoren in een autoclaaf. Bewaar de chirurgische instrumenten tijdens de operatie in 70% ethanol en laat ze vlak voor gebruik aan de lucht drogen op steriel gaas.
Spray het werkgebied twee uur voor de operatie in met 70% ethanol. Injecteer de muis met 0,05 milligram per kilogram buprenorfine. Het middel wordt direct na de operatie opnieuw toegediend, en daarna elke drie tot vijf uur gedurende de eerste 24 uur van de postoperatieve periode.
Gebruik een anesthesieverdampers om de muis te anesthetiseren met een gasmengsel van 3% ISOfluorine en 20% zuurstof. Stel de zuurstofhoeveelheid in met een debietmeter. Controleer de diepte van de anesthesie door in de teen of de staart te knijpen.
Handhaaf het niveau van anesthesie met 2% ISO fluorine. Breng kunsttranen aan in de ogen van de muis en wees voorzichtig om beschadiging van het oog tijdens de chirurgische procedure te voorkomen.
Plaats de muis op zijn rechterzijde in een laterale positie met behulp van de dierentrimmer. Scheer het gebied aan de linkerzijde tussen het linkeroog en de basis van de linkeroor. Reinig het gebied door afwisselend een Betadine-oplossing en 70%eth ethanol aan te brengen met wattenstaafjes door het gebied lichtjes in te wrijven.
Herhaling is noodzakelijk. Plaats de muis op een warmtemat die is aangesloten op een rectale probe. Om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden, wordt de rectale probe ingebracht met behulp van minerale olie. Positioneer de muis op zijn rechterzijde onder de microscoop en zet deze vast met tape.
Knip een opening in een gaasje en bedek het operatiegebied met een fijne rechte schaar. Maak een verticale incisie tussen het linker oog en de basis van het linker oor. Gebruik gebogen hemostaten om het operatiegebied open te houden als er tijdens de operatie overmatige uitdroging van het weefsel optreedt.
Gebruik wattenstaafjes om steriele PBS aan te brengen. Gebruik veerscharen om een horizontale incisie in de musculus temporalis te maken en trek deze langzaam met een pincet uiteen om de musculus temporalis voorzichtig van de schedel te scheiden. Houd het kaakbeen vast met een gebogen pincet en gebruik een naald van 18 gauge om een kleine subtemporale craniotomie te maken op het kruispunt van de zygomatische boog en het squamosum.
Met behulp van botronsnijders worden kleine stukjes van de schedel verwijderd om de MCA bloot te leggen. De jukbeugelvormige boog en de inhoud van de oogkas mogen tijdens dit proces niet beschadigd raken. Ligateer het distale deel van de MCA met een kleine vatcauterisator, plaats de temporele spier terug in de oorspronkelijke positie en gebruik hiervoor nylon hechtingen van maat 5-0.
Om de incisieplaats te sluiten, wordt de anesthesie gestaakt en wordt de rectale probe verwijderd. Injecteer de muis subcutaan met een tweede dosis buprenorphine. Plaats de muis terug in de kooi, die op 37 °C is gehouden.
Met een verwarmingspaneel. Houd de muis gedurende de volgende 24 uur nauwlettend in de gaten op tekenen van ongemak, waaronder een afname van de eetlust of waterconsumptie, een gebogen houding, verhoogde ademhaling of overeind staand haar (piloerectie). Geef de muis direct na de operatie herstelgel.
Wacht twee tot drie uur na de operatie. Injecteer de muis vervolgens elke drie tot vijf uur subcutaan met buprenorfine, tot maximaal 24 uur na de ingreep. Anestheseer de muis 24 uur na de operatie diep en perfuseer de muis met 4% TTC.
Verwijder de hersenen en plaats deze gedurende de nacht in een 4% paraformaldehydeluutie. Plaats de hersenen de volgende dag in het snijblok. Gebruik scheermesjes om de hersenen in plakjes van één millimeter dik te snijden.
Plaats de plakjes naast een liniaal met een millimeter-schaal. Fotografeer de plakjes met een digitale camera die is aangesloten op een dissectiemicroscoop via de Image J-software.
Klik op het bestandmenu en open de gewenste foto. Klik in het programma op het tabblad voor de rechte lijn. Trek een rechte lijn tussen de twee markeringen op de liniaal.
Klik op het analysemenu en selecteer 'set scale'. Stel de bekende afstand in op één en de lengte-eenheid op millimeter. Klik op het tabblad 'freehand circle'.
Teken een cirkel om de contralaterale hemisfeer te omlijnen. Klik op het analysemenu en selecteer 'measure'. Er verschijnt een berekeningsvenster waarin de oppervlakte van de getekende cirkel wordt weergegeven.
Teken een andere cirkel rond de ipsilaterale hemisfeer, met uitzondering van het wit omlijnde gebied. Meet het oppervlak zoals eerder beschreven. De nieuwe waarde wordt toegevoegd aan het berekeningsvenster.
Het verschil tussen de eerste en tweede waarde vertegenwoordigt het oppervlak van het infarct. Bereken het infarctoppervlak in elke coupes door de bovenstaande stappen te herhalen voor coupesdiktes van één millimeter. Bereken het infarctvolume door het berekende infarctoppervlak van elke coupe bij elkaar op te tellen.
Deze figuur toont de TTC-kleuring van de hersenen 24 uur na permanente MCA-ligatie bij een wild-type C 57 BL six muis. De locatie van het infarct is wit van kleur en is zichtbaar vanuit verschillende vergrotingen en hoeken. Hier worden coupes van één millimeter dik getoond van de TTC-gekleurde hersenen met infarct, van anterior naar posterior.
Het volume werd 24 uur na de operatie berekend. Het volume van het infarct is ongeveer 23 kubieke millimeter zodra het is voltooid. Deze techniek kan in 30 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Bedankt voor het kijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De techniek voor ligatie van de arteria cerebri media (MCA) wordt gebruikt om focale cerebrale ischemie in diermodellen te bestuderen. Deze methode omvat het blootleggen en ligeren van de arteria cerebri media, wat resulteert in reproduceerbare infarctvolumes en verbeterde postoperatieve overlevingstijden.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beroerteonderzoek
- Diermodellen
Achtergrond
- Focale cerebrale ischemie is een cruciaal onderzoeksgebied voor het begrijpen van beroertes.
- De methode van MCA-ligatie maakt gecontroleerde experimenten mogelijk.
- Diermodellen bieden inzicht in de mechanismen van beroertes bij mensen.
- Verbeterde overlevingspercentages verhogen de betrouwbaarheid van de resultaten.
Doel van de studie
- Om de effecten van focale cerebrale ischemie te onderzoeken.
- Om infarctvolumes in een gecontroleerde setting te evalueren.
- Om het begrip van de pathologie van beroertes te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Incisie gemaakt tussen het linker oog en de basis van het oor.
- Craniotomie uitgevoerd bij de jukboog en het squamale bot.
- Middelste cerebrale arterie geligeerd met behulp van een cauterisator voor kleine vaten.
- Huid gehecht om de wond na de procedure te sluiten.
Belangrijkste resultaten
- Infarct gelokaliseerd in de linkerhemisfeer van het muizenbrein.
- Visualisatie van het infarct bereikt via TTC-kleuring of MRI.
- Resultaten tonen de effectiviteit van de MCA-ligatietechniek aan.
- Hoge reproduceerbaarheid van de infarctvolumes waargenomen.
Conclusies
- MCA-ligatie is een betrouwbare methode voor het bestuderen van focale cerebrale ischemie.
- Verbeterde overlevingspercentages dragen bij aan de validiteit van de bevindingen.
- Deze techniek kan worden gebruikt voor verder onderzoek naar therapieën tegen beroerte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het model voor permanente ligatie van de arteria cerebri media biedt een reproduceerbaar systeem voor het bestuderen van focale cerebrale ischemie, wat mechanistische risicoreductie van neuroprotectieve verbindingen in preklinisch beroertenonderzoek mogelijk maakt. Door consistente infarctvolumes in muizen te genereren, ondersteunt deze methode de validatie van targets en de ontwikkeling van assays voor therapeutische kandidaten die inspelen op onvervulde behoeften bij ischemische beroerten. De relevantie voor de menselijke pathologie — waarbij ongeveer 80% van de beroerten in het MCA-territorium optreedt — vergroot het translationele vertrouwen en de portfolio-triage in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen in ischemische routes te onderzoeken via gecontroleerde inductie van focale ischemie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de betrokkenheid van het doelwit bij de vorming van de infarctkern en de penumbra te verduidelijken.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare infarctkwantificering via TTC-kleuring, wat een consistente beoordeling van de target engagement faciliteert.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op compound-screening door het vestigen van een ziekterelevant ischemie-model.
- Operationele waarde: Standaardiseert de infarctmeting via TTC-gebaseerde volumetrie, wat kwantitatieve dosis-responsanalyse mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay met overlevingspercentages van ~80%, waardoor de variabiliteit in farmacologische resultaten wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert menselijke beroertepathologie met een hoge anatomische en pathofysiologische relevantie voor infarcten in het MCA-gebied.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt evaluatie van intracellulaire responsmechanismen op hypoxie in vivo mogelijk, wat de ontdekking van biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via gestandaardiseerde chirurgische en kleuringsprotocollen.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische efficiëntietests, en biedt een platform voor mechanistische risicoreductie van therapieën tegen beroertes.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van neuroprotectieve targets door gecontroleerde ischemische insults en infarctkwantificatie mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde TTC-kleuring, wat resulteert in kwantitatieve infarctvolume-outputs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert volumetrische metingen (bijv. ~23 mm³ infarct na 24h) die vergelijkingen tussen condities en de bepaling van de effectgrootte mogelijk maken.
- Translational Research: Legt de verbinding met preklinische continuïteit doordat de infarctlokalisatie menselijke beroertepatronen weerspiegelt, wat helpt bij risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar platform voor het evalueren van meerdere verbindingen over verschillende projecten heen vanwege de reproduceerbaarheid en gestandaardiseerde eindpunten.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in ischemische pathways te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde procedures voor craniotomie, ligatie en TTC-kleuring.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare infarctgegevens te verschaffen, waardoor biologische risico's in een laat stadium binnen stroke-programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve kandidaten mogelijk op basis van consistente signalen van preklinische werkzaamheid.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgie bij knaagdieren en neuroanatomische identificatie van de MCA.
- Afhankelijk van microsurgisch instrumentarium, waaronder vatcauterisatoren, warmtematten en precisiehechtinstrumenten.
- Vereist teamoverschrijdende standaardisatie van protocollen voor anesthesie, analgesie en postoperatieve monitoring.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het vertalen van technieken van ratten- naar muismodellen, inclusief hechtdraadmaat en occlusieprecisie.
- Beperkt door de noodzaak van terminale eindpunten om infarctkwantificatie uit te voeren via TTC-kleuring of MRI.
