Enzym-gekoppelde immunosorbeertest om chemisch-gekoppelde antilichaam-antigeen-conjugaten te verifiëren

Om een immuunrespons teweeg te brengen, binden antigenen aan de antilichamen die specifiek zijn voor de endocytische receptoren die aanwezig zijn op het oppervlak van dendritische cellen, of DC's — de antigeen-presenterende cellen — die helpen bij de opname van antigenen.

De vorming van een antilichaam-antigeen complex is een cruciale stap en kan in vitro worden bereikt door het antigeen chemisch te koppelen aan een DC-targeterend monoklonaal antilichaam.

Om de efficiëntie van het conjugatieproces te verifiëren, begin met een ELISA-plaat vooraf bedekt met de gevangen antilichamen. Behandel de plaat met een blokkeeroplossing om de niet-specifieke binding van de antigenen aan het gecoate oppervlak te voorkomen.

Voeg chemisch gecrosslinkte, antilichaam-antigeen-conjugaten toe aan de plaat en incubeer. Het specifieke epitoop van het antigeen interageert met het paratoom van het gevangen antilichaam waardoor een antilichaam-antigeen-antilichaam complex wordt gevormd.

Bedek vervolgens de plaat met een derde set antilichamen gekoppeld aan een enzym. Deze antilichamen binden specifiek aan de primaire antilichamen aanwezig in het conjugaat, waardoor detectie mogelijk wordt.

Voeg een buffer toe die het chromogene substraat bevat om de conjugaten te visualiseren. Het enzym dat aan het antilichaam is gehecht, reageert met het substraat en genereert het gekleurde product.

Behandel de plaat met een aangezuurde inactivatieoplossing, die het enzym inactiveert en de reactie beëindigt. Analyseer de plaat spectrofotometrisch. De aanwezigheid van een gekleurde oplossing verifieert de aanwezigheid van antilichaam-antigeen-conjugaten en bevestigt een succesvolle conjugatie.

Om het succes van de conjugatie door ELISA te verifiëren, bedek een geschikte 96-well ELISA-plaat met 100 microliter van het anti-OVA-antilichaam per put, en verdun serieel anti-DEC-205/OVA in een 1:2-verhouding in blokkeerbuffer, om verdunningsreeksen te verkrijgen van 6 microgram per milliliter tot 93,8 nanogram per milliliter.

Voeg 100 microliter van elke verdunning toe aan de juiste putten van de met antilichamen gecoate plaat voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie 100 microliter peroxidase-geconjugeerd antilichaam tegen het anti-DEC-205/OVA-conjugaat toe aan de plaat voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 50 microliter peroxidase-substraat toe aan elke put om analyse van de kleurreactie door spectrofotometrie mogelijk te maken.