Waarom is het meten van de neurietlengte belangrijk voor targetvalidatie?

De neurietenlengte dient als een kwantitatieve fenotypische readout om te beoordelen of een doeleiwit de ontwikkeling van neuronale uitlopers stimuleert of remt, waardoor functioneel bewijs wordt geleverd dat verder gaat dan de bevestiging van de expressie.

Hoe draagt het isoleren van EGFP en de expressie van het doeleiwit bij aan de doelstellingen van de discovery pipeline?

Tweekleurige fluorescentie maakt specifieke identificatie van co-getransfecteerde neuronen mogelijk, waardoor wordt gewaarborgd dat de waargenomen neuriet-effecten toeschrijfbaar zijn aan het doelwit-eiwit in kwestie en niet aan variabiliteit in de transfectie.

Wat maken kwantitatieve neurietmetingen mogelijk bij de beoordeling van targets?

Kwantitatieve gegevens over de lengte van neurieten maken een statistische vergelijking tussen verschillende condities mogelijk, wat dosis-responsanalyse en de selectie van hits in screeningcampagnes ondersteunt.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor cross-functionele samenwerking?

Het imagen van ten minste 40 EGFP-positieve neuronen per conditie waarborgt voldoende statistische kracht, waardoor betrouwbare gegevensuitwisseling tussen discovery biology- en preklinische teams mogelijk wordt.

Welke statistische analyse is vereist voordat deze assay in een screeningsworkflow wordt geïmplementeerd?

Basisvergelijkende statistiek (bijv. t-toetsen of ANOVA) is vereist om significante verschillen in neuritelengte tussen de controlegroep en de doelwit-expressiegroepen vast te stellen, ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen.

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 3:52 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Developing neurons extend cytoplasmic processes from their cell bodies by neurite outgrowth to develop dendrites and axons, which are essential for neuron-to-neuron communication.

To study the effect of a target protein on neurite outgrowth, take a multiwell plate with a poly-D-lysine-coated coverslip at its base. The coverslip's surface has an adherent culture of primary cortical neurons derived from the embryonic rat brain.

Treat the neurons with a mix containing two types of plasmids — an EGFP plasmid encoding enhanced green fluorescent protein and a second plasmid encoding the target protein in a suitable transfection reagent.

The transfection reagent facilitates the entry of the plasmids into the cells.

Post-transfection, both plasmids get expressed, producing green fluorescent proteins and target proteins. The expression of EGFP imparts green fluorescence to the co-transfected cells.

Target proteins with neurite outgrowth-stimulating potential initiate cellular signaling, which promotes cytoskeleton reorganization and leads to the development of neuronal projections and their extensions.

Aspirate the spent medium, and fix the cells with paraformaldehyde. Counterstain the cells using red fluorescence-tagged anti-target protein antibodies that specifically bind expressed target proteins and impart additional red fluorescence to the cells.

Remove the coverslip from the culture plate, and observe it under a fluorescence microscope.

Co-transfected cells exhibiting a dual-colored fluorescence signal show longer neuronal processes than cells lacking red fluorescence, confirming the target protein's stimulating effect on neurite outgrowth.

After two days at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide, dilute EGFP and target protein plasmid DNAs and transfection reagent in two separate 1.5-milliliter tubes, and then, mix them together. Transfect the cells with EGFP construct by adding the transfection mix to the wells.

After 24 hours, wash the cells with 37 degrees Celsius PBS, and fix them with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes in the dark at room temperature.

At the end of the incubation, wash the fixed cells three times with fresh PBS per wash, and add a minimal volume of fluorescence mounting medium onto one microscope glass slide, per sample. Then, carefully transfer the coated coverslips onto the mounting medium, with the samples facing the glass slides.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschappelijk gebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in Escherichia coli

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Luminescence-Based Assay to Assess Neurotoxicity of Test Compounds on Neurons

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen In Vitro En In Vivo Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons