Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophages
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Technieken
0 weergaven • 3:25 min • July 8th, 2025
To enumerate bacteriophages via quantitative polymerase chain reaction, qPCR, obtain a qPCR reaction cocktail containing Taq DNA polymerase, primers, deoxynucleotide triphosphates — dNTPs — and fluorescent reporter dye molecules in an optimized buffer. Transfer into a qPCR plate's wells.
Add heat-treated bacteriophages. Heat treatment releases bacteriophage DNA from bacteriophage particles. Seal the plate, preventing mixture evaporation. Load the plate into the qPCR system, setting appropriate cycling conditions.
Heating to high temperatures denatures the double-stranded DNA into single strands. It also activates the Taq DNA polymerase. Annealing causes sequence-specific primers to bind to the complementary bacteriophage DNA strands. Extension allows activated Taq DNA polymerase to add dNTPs to the 3' end of the primer, extending the growing DNA strand in the 5' to 3' direction.
The dye molecules intercalate into the newly synthesized double-stranded DNA, causing increased fluorescence intensity. Each PCR cycle doubles the target DNA amount, increasing the fluorescence intensity.
Determine the threshold cycle, Ct, value, at which measured fluorescence exceeds the background level.
The Ct value is inversely related to the starting DNA amount, with each bacteriophage genome equivalent to one bacteriophage particle, facilitating bacteriophage quantification from the bacteriophage DNA standard curve.
Post-amplification, perform melt curve analysis, gradually increasing the reaction temperature. At a specific melting temperature, half the DNA separates into single strands, releasing dye molecules and causing sudden fluorescence decrease.
A distinct melting temperature, unique for the qPCR product, validates the product specificity.
Prepare the qPCR premix for 10 biopanned phage samples of unknown concentration and 7 samples of standard concentrations in triplicate, resulting in a premix for 51 samples containing 255 microliters of qPCR Master Mix, 51 microliters of primers, and 102 microliters of water.
Aliquot 8 microliters of the prepared PCR mix into 51 wells of a 96-well qPCR plate. Next, add two microliters of heat-treated T7 phage samples to each of these wells, dispensing it below the surface of the qPCR premix. Using adhesive film, seal the plate.
Wrap the plate in aluminum foil to minimize fluorescence photobleaching, and then, proceed to run the plate on the qPCR equipment. Set up the cycling conditions and melt curve settings as outlined in the text protocol.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail een methode voor het tellen van bacteriofagen met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). Het proces omvat het bereiden van een qPCR-reactiecocktail, het toevoegen van hittebehandelde bacteriofagen en het analyseren van de resulterende fluorescentie om de hoeveelheid bacteriofaagdeeltjes te kwantificeren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Moleculaire Biologie
- Kwantitatieve Analyse
Achtergrond
- Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën infecteren.
- Kwantitatieve PCR is een techniek die wordt gebruikt om DNA te amplificeren en te kwantificeren.
- Hittebehandeling wordt gebruikt om bacteriofaag-DNA uit de partikels vrij te maken.
- Fluorescerende kleurstoffen helpen bij het detecteren van het geamplificeerde DNA.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het kwantificeren van bacteriofagen.
- Om het gebruik van qPCR in bacteriofagenonderzoek te demonstreren.
- Om een standaardcurve vast te stellen voor kwantificeringsdoeleinden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een qPCR-reactiecocktail met de benodigde componenten.
- Hittebehandeling van bacteriofagen om DNA vrij te maken.
- Het opzetten van een qPCR-plaat met monsters en controles.
- Het uitvoeren van de qPCR met specifieke cycluscondities en smeltcurve-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle amplificatie van bacteriofaag-DNA is bereikt.
- De fluorescentie-intensiteit correleerde met de hoeveelheid DNA.
- Onderscheidende smelttemperaturen valideerden de productspecificiteit.
- Er is een standaardcurve opgesteld voor kwantificatie.
Conclusies
- De qPCR-methode is effectief voor het kwantificeren van bacteriofagen.
- Deze techniek kan worden toegepast in diverse microbiologische studies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode voor verdere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Kwantitatieve PCR-gebaseerde enumeratie van bacteriofagen maakt precieze, high-throughput kwantificering van virale deeltjes mogelijk in workflows in de ontdekkingsfase. Deze aanpak ondersteunt robuuste targetvalidatie en assay-ontwikkeling door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te leveren die cruciaal zijn voor vroege besluitvorming. De integratie van qPCR-enumeratie in biofarmaceutische pipelines vergroot het voorspellende vertrouwen en de portfolio-triage voor fagengebaseerde of microbioom-modulerende therapieën.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de bacteriofaag-abundantie mogelijk voor hypothese-gestuurde studies.
- Ondersteunt functionele validatie van faagdoelen via DNA-gebaseerde enumeratie.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door de aanwezigheid en concentratie van fagen te bevestigen.
- Biedt datacontinuïteit voor portfoliotriage en vroege go/no-go beslissingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantificering voor assay-kalibratie en -validatie.
- Maakt high-throughput screening van faagmonsters met kwantitatieve resultaten mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van het platform en de vergelijkbaarheid tussen studies via Ct-gebaseerde metingen.
- Bereidt gevalideerde faagkwantificatiesystemen voor op downstream evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt kwantitatieve faagenumeratie af op translationele biomarkerstrategieën wanneer dit relevant is.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie voor faaggebaseerde interventies.
- Vermindert biologische ambiguïteit bij de selectie en verdere ontwikkeling van preklinische modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling met kwantitatieve gegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Fagenumeratie op basis van qPCR past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot identificatie van lead-compounds en levert kwantitatieve resultaten voor hypothesetoetsing en assay-gereedheid.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en de verduidelijking van pathways door het kwantificeren van faag-DNA.
- Screening: Maakt reproduceerbare, kwantitatieve resultaten mogelijk voor assay-standaardisatie en schaalbaarheid.
- Analytics: Levert Ct-waarden en standaardcurves voor een robuuste vergelijkende analyse tussen monsters.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de continuïteit van kwantitatieve gegevens van discovery tot preklinische validatie wanneer faagkwantificering relevant is.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbare, gestandaardiseerde workflow voor faagenumeratie over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de kwantificering van fagen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor enumeratie.
- Strategische waarde: Verbetert vroege go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van kwantitatieve resultaten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van fagerelateerde activa mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp en de optimalisatie van qPCR-assays.
- Toegang tot qPCR-instrumentatie en fluorescentiedetectiesystemen is noodzakelijk.
- Standaardisatie van monstervoorbereiding en cycluscondities tussen verschillende teams is vereist.
- Aanpassing voor verschillende faagtypen of monstermatrices kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van gevalideerde standaardcurves en smeltcurve-analyse voor specificiteit.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie evaluatie van microRNA-expressie in nier en serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een aangepaste op optische dichtheid gebaseerde microplaattest voor het karakteriseren van actinobacteriofaaginfectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026