Waarom neemt de anisotropie toe bij eiwitbinding?

Anisotropie neemt toe wanneer ongelabelde eiwitten binden aan met fluorofoor gelabelde targets, waardoor de moleculaire grootte van het complex toeneemt en de rotatiebeweging afneemt. Dit resulteert in meer verticaal gepolariseerd uitgezonden licht ten opzichte van horizontaal gepolariseerd licht. De verandering wordt gemeten als een hogere anisotropiewaarde, wat duidt op een succesvolle interactie.

Hoe wordt het percentage gelabelled eiwit bepaald?

Het percentage gelabeld eiwit wordt gekwantificeerd door de absorbentie bij 280 nm en 508 nm te meten met een spectrophotometer en een kwartscuvet, waarna de wet van Lambert-Beer wordt toegepast. Deze stap zorgt voor een nauwkeurige normalisatie van de anisotropiegegevens ten opzichte van de fractie succesvol gelabelde doeleiwitten. Dit wordt uitgevoerd nadat ongebonden kleurstof is wegedialyseerd om interferentie door vrije fluorofoor te verwijderen.

Wat geeft een niet-lineaire toename van de anisotropie aan?

Een niet-lineaire toename van de anisotropie bij een stijgende concentratie van het ongelabelde eiwit suggereert binding op meerdere niet-identieke plaatsen op het fluorofoor-gelabelde target. Dit patroon weerspiegelt heterogene bindingsaffiniteiten of coöperatieve interacties in plaats van een model met één enkele bindingsplaats. Dergelijke gegevens ondersteunen een diepere mechanistische analyse van de complexiteit van de interactie.

Waarom is replicatie belangrijk bij anisotropie-titraties?

Replicatie zorgt ervoor dat elke titratiestap homogeen is en dat het gehele monster gelijkmatig is gemengd vóór de meting. Inconsistent mengen kan variabiliteit in de anisotropiewaarden veroorzaken, wat de interpretatie van de bindingscurve kan bemoeilijken. Zorgvuldige replicatie ondersteunt een betrouwbare data-fitting aan bindingsmodellen en de vergelijkbaarheid tussen experimenten.

Welke analytische stap volgt op de verzameling van anisotropiegegevens?

Na het verzamelen van anisotropiewaarden over een titratieserie worden de gegevens gefit aan een verondersteld bindingsmodel, zoals beschreven in het protocol. Deze stap maakt de kwantificering van bindingsaffiniteit, stoichiometrie en potentiële coöperativiteit mogelijk. Modelfitting transformeert ruwe anisotropiemetingen in bruikbare inzichten voor targetvalidatie en leadoptimalisatie.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Technieken

0 weergaven • 3:41 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

For fluorescence anisotropy-based protein-protein interaction detection, begin with recombinant target proteins tagged with C-terminal tetracysteine motifs in a suitable anisotropy buffer.

Add a fluorophore-containing dye — binding to target proteins via the tetracysteine motif. Dialyze with the anisotropy buffer, removing unbound dye. Transfer the mixture to quartz cuvettes. Measure the absorbance, determining the percentage of successfully-labeled target proteins.

In a fluorescence cuvette, mix the fluorophore-labeled target proteins with unlabeled proteins. Using a spectrofluorometer, measure fluorescence anisotropy.

As the target proteins suspend freely in the buffer, the fluorophores attached to them rotate randomly around their axes due to Brownian motion. Upon excitation with vertically-polarized light of an appropriate wavelength, the fluorophores emit light polarized in the vertical and horizontal planes. The ratio of the fluorescence intensities of the vertical and horizontally polarized emissions — anisotropy — is measured.

When unlabeled proteins bind to the fluorophore-labeled targets, the molecular size of the protein complex increases, reducing its rotational motion. As a result, the emitted light becomes more polarized, with higher emission in the vertical plane than the horizontal plane — increasing anisotropy.

Add increasing concentrations of the unlabeled protein and repeat the anisotropy measurement.

A non-linear increase in anisotropy with increased unlabeled protein addition indicates unlabeled protein binding at multiple non-identical binding sites on the fluorophore-tagged target proteins.

Mix 3 nanomoles of the SBDS-FlAsH protein with 3 nanomoles of the Lumio Green dye in a 5-microliter volume of anisotropy buffer. Let the reaction proceed for 8 hours at 4 degrees Celsius. After 8 hours, dialyze the sample against the anisotropy buffer overnight to remove the free dye. Measure the absorbance at 280 nanometers and 508 nanometers in a spectrophotometer using a quartz cuvette. Then, use the Lambert-Beer law to quantify the percent of labeled protein as described in the text protocol.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Leidinggevenden

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor de implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

Fluorescence Anisotropy to Determine Transcription Factor-DNA Binding Affinity

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay