Geoptimaliseerde PCR-gebaseerde detectie van Mycoplasma

Het algemene doel van deze procedure is om visueel de stappen te demonstreren voor het gebruik van de lookout mycoplasma PCR-detectiekit, geoptimaliseerd voor het detecteren van mycoplasma-contaminatie. Dit wordt bereikt door de monsters eerst te verhitten tot 95 °C om eventuele DNA-moleculen te inactiveren die het gewenste template ongeschikt voor PCR zouden kunnen maken. Bereid vervolgens de monsters voor op de PCR met behulp van de meegeleverde buisjes die zijn voorgecodeerd met nucleotiden, primers en intern controle-DNA.

De derde stap van de procedure is de temperatuurcycli onder zorgvuldig geoptimaliseerde omstandigheden om de hoogste gevoeligheid te bereiken en aspecifieke amplificatie te elimineren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen om via evaluatie met agarosegelelektroforese te bepalen of de betreffende monsters besmet zijn met mycoplasma. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de reagentia vooraf zijn klaargemaakt en hoogwaardige PCR-buisjes worden gebruikt.

Dit maakt het proces handiger en efficiënter. Een ander voordeel van deze kit is dat er minder dan twee mycoplasmagenomen per microliter monster nodig zijn om contaminatie te detecteren. Bij het uitvoeren van de procedure voor mycoplasmadetectie is het belangrijk om elke mogelijke contaminatie te vermijden door passende persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken om blootstelling van de huid tot een minimum te beperken, ervoor te zorgen dat alle gebruikte reagentia vrij zijn van contaminatie en te allen tijde een correcte aseptische techniek te hanteren.

De procedure kan direct worden uitgevoerd op supernatanten van celculturen, of monsters kunnen worden klaargemaakt voor gebruik op een later tijdstip. Om monsters voor later gebruik voor te bereiden, plaatst u 100 µL van elke supernatant in een steriele amplificatiebuis en incubeert u deze vijf minuten bij 95 °C. Na de incubatie kunnen de monsters tot een week worden bewaard bij 2 tot 8 °C.

Centrifugeer de monsters kort vlak voor het testen om eventueel cellulair debris te pelletteren. Bepaal bij de voorbereiding van de monsters voor PCR eerst het totale volume DNA-polymerase rehydratatiebuffer dat nodig is voor de reacties. Eén unit DNA-polymerase per reactie moet worden toegevoegd aan het juiste volume rehydratatiebuffer, wat varieert afhankelijk van de tac die in deze demonstratie wordt gebruikt; jumpstart TAC D 93 0 7 zal worden gebruikt in vijf reacties, bestaande uit drie monsters, één positieve controle en één negatieve controle.

Plaats het berekende volume DNA-polymerase in een schone microcentrifugebuis en voeg vervolgens het berekende volume rehydratiebuffer toe. Meng de DNA-polymerase-rehydratiebuffer voorzichtig door tegen de buis te tikken. Vortex dit mengsel niet.

Gebruik de transparante reactiebuisjes uit de kit om de negatieve controle en de monsters voor te bereiden. Deze reactiebuisjes bevatten al de nucleotiden, primers en het interne controledNA; pipetteer 23 µL van de eerder bereide rehydratatiebuffer voor DNA-polymerase in de buisjes. Meng dit in elk van de negatieve controle- en monsterbuisjes.

Voeg vervolgens 2 µL DNA-vrij water toe aan de negatieve controle en 2 µL van elk monster aan de respectieve monstertubes. Meng de inhoud door tegen de tubes te tikken. De inhoud mag niet worden gevortext.

Gebruik voor het voorbereiden van de positieve controle de roze reactiebuisjes die in de kit zijn meegeleverd. Deze reactiebuisjes bevatten reeds de nucleotiden, primers en interne controle-DNA; voeg 25 µL DNA-polymeraserehydratiebuffer-mix toe aan het reactiebuisje. Meng de inhoud door kort tegen de wand van het buisje te tikken; de inhoud mag niet worden gevortexd.

Incubeer vervolgens de positieve controle, de negatieve controle en de monsterbuisjes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng na vijf minuten alle reactiebuisjes over naar een thermocycler. Stel voor de PCR de volgende condities in voor 40 cycli.

94 °C gedurende 30 seconden. 55 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende 40 seconden. Een activatiestap is niet vereist bij gebruik van Jumpstart tack.

Zodra de PCR-cycli zijn voltooid, verwijdert u de monsters uit de thermocycler en plaatst u deze op ijs om af te koelen tot vier tot acht graden Celsius. De monsters kunnen vervolgens direct op een agarosegel voor elektroforese worden geladen; breng acht µL van elke PCR-reactie aan in een aparte lane. Er hoeven geen laadbuffer en kleurstof te worden toegevoegd vóór het laden van de monsters, aangezien deze al in de reactiebuisjes zijn opgenomen.

Stop de elektroforese nadat de trackingskleurstof 2,5 tot drie centimeter is gemigreerd. Representatieve resultaten van het detecteren van mycoplasma via PCR worden getoond in deze afbeelding van een agarosegelbaan. Nummer twee is de negatieve controle, die een band moet vertonen op ongeveer 481 baseparen.

De afwezigigheid van de negatieve controleband bij 481 basenparen is een goede indicator dat de gebruikte TAC niet gevoelig genoeg was. Mycoplasma-positieve monsters vertonen banden in het bereik van 270 plus of min acht basenparen, zoals te zien is in banen drie tot en met zes. De band zal sterk zijn voor sterk besmette monsters en zwak voor licht besmette monsters.

Alle monsters bevatten een interne negatieve controle om aan te tonen dat de PCR zoals verwacht is verlopen. Het is normaal dat de interne controle afwezig is bij sterk verontreinigde monsters. De afwezigheid van een band in zowel het positieve als het negatieve bereik, zoals te zien in baan zeven, is een goede indicator dat de monsters geremd zijn.

Indien het monster is geremd, kunnen de PCR-inhibitoren worden verwijderd door een DNA-extractie uit te voeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u alle noodzakelijke stappen kunt uitvoeren zoals beschreven in de procedure van de kit, en hoe u de resultaten interpreteert en eventuele problemen oplost wanneer dat nodig is.