Name: Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer regeneratie-assays manipuleren bij planaria door farmacologische en genetische methoden toe te passen. Deze technieken helpen onderzoekers stamceldifferentiatie en regeneratieve biologie bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werken in het lab wordt ondersteund door NSF (MCB0919933) en NIH (GM088790).

1. Trunk fragment regeneratie-test <ol><li> Stop met het voeden van een cohort van wormen voor ten minste 5 dagen voor de regeneratieve test om ervoor te zorgen de dieren vrij zijn van afval en ingenomen voedsel (~ 30 intacte wormen, elke worm ~ 8-10 mm lang na de honger). </li><li> Op de dag van de test, spoel een pre-bevroren genivelleerd ijs schotel met water en dek de vlakke bevroren oppervlak met plastic wrap. Met behulp van een tang, plaats een filter papier op de plastic verpakking. </li><li> Bevochtig het filtreerpapier met een paar druppels bronwater. Overdracht planarians op filter (&lt;20 wormen per filter) met behulp van een overdracht pipet. Wormen kunnen worden verplaatst op de filter, indien nodig, door repipetting met meer bronwater. Verwijder overtollige vloeistof. </li><li> Met behulp van een scalpel, amputeren het hoofd door een enkele snede ongeveer halverwege tussen het voorste punt van het dier en de voorste einde van de keelholte (figuur 1a). </li><li> Met behulp van een scalpel, amputeren van de staart regio door een snede gemaakt ongeveer halverwege tussen de staart van het dier en achterste einde van de keelholte (figuur 1a). Verwijder overtollig slijm op de scalpel met behulp van een papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol na het snijden. Veeg overtollige ethanol uit scalpel. </li><li> Transfer filter via pincet in een petrischaal (100 x 25mm diep) met bronwater. Wacht ~ 3 minuten (voor wondsluiting, waarneembaar door een te knijpen en donker worden van de wond). </li><li> Spoel stam fragmenten uit filtreerpapier in petrischaal met gewenste medium voor regeneratieve assay en transfer naar thermostatted incubator (24 ° C). </li><li> Score regeneratieve fenotype na ~ 1 week, wanneer geregenereerd structuren te identificeren (Figuur 1A). </li></ol> 2. Farmacologische manipulatie van regeneratie: bipolariteit geïnduceerd door praziquantel <ol><li> Bereid praziquantel (PZQ) voorraad door de oplossende medicijn in DMSO (62.4mg PZQ in 1 ml voor 200mm voorraad). Gebruik op dezelfde dag. </li><li> Maak 50ml van geneesmiddel-bevattende oplossing (90 uM PZQ) in een gebufferde Montjuch zouten. Vortex voor ~ 1 minuut dispersie te garanderen. </li><li> Voer kofferbak fragment regeneratieve assay zoals hierboven beschreven [protocol # 1], het blootstellen van een cohort van de romp fragmenten PZQ bij de laatste stap [1,7]. </li><li> Na 24-48 uur, wisselen PZQ-bevattende media voor bronwater, wassen wormen meerdere (&gt; 3) keer. </li><li> Keer terug naar wormen incubator. Score bipolariteit (twee koppen, Figuur 1B) een week na het snijden. </li></ol> 3. Genetische manipulatie van regeneratie: in vivo RNAi voeden protocol <ol><li> Voorafgaand aan de test, voor te bereiden kip leverhomogenaat. Gooi vettige, geel gekleurde delen van foodstock, en pureer de resterende lever. Filter puree door de mesh zeef en de hoeveelheid suspensie voor opslag (1,5 ml buizen, -20 ° C). </li><li> Voorafgaand aan de test, voor te bereiden van runderen rode bloedcellen (RBC&#39;s) door aliquoting het aanbod in 1 ml monsters, bewaard bij -20 ° C. </li><li> Selecteer de wormen voor de RNAi. Drie cohorten worden gebruikt: gen van belang, de positieve controle (gen waarvan bekend is RNAi fenotype, figuur 1C, D &amp; E) en de negatieve controle (gen zonder RNAi fenotype, ook nuttig voor de beoordeling van knockdown niveaus ten opzichte van experimentele cohort). Voor elke cohort, gebruik ~ 250 wormen (~ 8-10 mm lang na honger voor ten minste 5 dagen). Bewaren in bronwater in plastic kuip. </li><li> Voor elke RNAi cohort, ontdooien voorraad van E. coli te drukken dsRNA richten gen van belang [8], samen met een buis van kippenlever homogenaat [3,1] en een buis van RBC&#39;s [3,2]. </li><li> Pellet bacteriën (13.000 g, 1 minuut). Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, gooi supernatans, plaats pellet op ijs. </li><li> Maak een grote diameter P200 pipetpunt door het afsnijden van het einde van de tip. Grondig resuspendeer de bacteriële pellet in een mengsel van kippenlever homogenaat (150 pi) en RBC (50 ul) om RNAi voeden mix te maken. Verwijder luchtbellen door middel van centrifugeren. </li><li> Voor het voeden, verwijder het grootste deel van het water uit de plastic kuip met wormen (laat ~ 1 inch diepte). Swirl bad om wormen te concentreren in het centrum van deze container, en pipet RNAi voeden mix in een cirkel in bedwang wormen. Gebruik een transfer pipet voorzichtig terug te coax ontsnapte op de RNAi voeden mix zonder verstoren andere gasten! </li><li> Na het voeren (~ 1 uur), te identificeren planarians dat gevoed goed. Deze wormen vertonen een dieprode kleur van de ingenomen RBC. Gooi anderen. </li><li> Plaats voorzichtig het voeden met een fris bronwater, het minimaliseren van verstoring van egestion van voedsel te voorkomen. Om dit te doen, voorzichtig lokaliseren van de wormen aan een kant van de buis met behulp van een transferpipet, uitgieten troebel water, en voorzichtig met vers water naar binnen giet de tegenoverliggende wand van het bad te vervangen. Resubmerge planarians snel als langdurige blootstelling aan lucht resulteert ook in voedsel egestion. </li><li> Losjes seal deksel en terug te keren naar incubator (24 ° C) </li><li> Herhaal RNAi voeden protocol over meerdere cycli (~ 2-3 dagen uit elkaar), afgewisseld met regeneratieve cycli [protocol # 1] om het scherm voor de RNAi fenotypes. Een standaard protocol voor het voeden en regeneratie effectief voor veel genen is weergegeven in figuur 2, die ~ 1 maand duurt in totaal duur. </li></ol> Wijzig deze regeling voor de verschillende genen, zoals een optimale protocol zal afhangen van factoren zoals de mRNA stabiliteit, weefsel lokalisatie, proteïne perdurance, of de ontwikkeling van een fenotype dat meerdere voeden cycli sluit na regeneratie. Beoordeel knockdown niveaus door simpelweg screening op penetrantie van het fenotype (indien zichtbaar), of door qPCR benaderingen om gerichte mRNA niveaus te vergelijken met negatieve controle cohort. 4. Representatieve resultaten: De stam fragment regeneratie test is robuust zodanig dat alle wormen te regenereren met een normaal anterior-posterior (&quot;kop tot staart &#39;) polariteit. Dit kan zodra de vijf dagen na het snijden, gefaciliteerd door de opkomst van de voorste oogvlekken (asterixed, Figuur 1A) worden gescoord. Echter, complete morfologische herstel van verloren structuren optreedt na een week. Farmacologische manipulatie van romp fragment wedergeboorte door PZQ tot twee-hoofdige wormen yield (Figuur 1B) is ook robuust (EG 50 = 87 (+ -) 11% bipolaire fragmenten, 70μM PZQ voor 48 uur en 20). Bipolariteit vindt plaats via een regeneratieve cyclus. Een lagere werkzaamheid bij deze testen gaat waarschijnlijk problemen met drugs oplosbaarheid en / of opslag of het gebruik van een andere soort platworm waar PZQ is ineffectief. Voor geneesmiddelen met een lagere penetrantie, is een anteriorization index vaak gebruikt om opzij scoren intermediaire fenotypen van volledige bipolariteit 22. Fenotypes als gevolg van RNAi van de positieve controle constructen zijn weergegeven in Figuur 1: RNAi van Dugesia japonica zes-1 (D j-zes-1) resulteert in een eyeless fenotype 23 (figuur 1C), RNAi van Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) resulteert in een verlies van de lichtschuwheid respons 24 (figuur 1D) en RNAi van Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulteert in een twee-hoofdige fenotype 16-19, 21 op de kofferbak van fragmenten (figuur 1E). Deze fenotypes kan worden bereikt met behulp van de volgende eenvoudige RNAi protocollen: Dj-zes-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), waarbij F = voeden cyclus en x = regeneratieve cyclus respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1:... Stam fragment regeneratie test A Links, Afbeelding van planarian (boven) en schematisch (midden) de locatie van de romp weggesneden fragment zien Recht, tijdsverloop van de romp fragment regeneratie zien verschijnen van regenereren fragment bij bepaalde tijden (dag) B beeld van twee-hoofdige planarian geproduceerd door PZQ exposure. &#39;Eyeless&#39; C worm geproduceerd door Dj-zes-een RNAi. D Verlies van lichtschuwheid respons in immobiele Dj-PC2 RNAi wormen (gekleurd rood), vergeleken met mobiele controle worm (in lood groen). E Bipolaire planarian geproduceerd door Dj-βcatenin-1 RNAi. BE in de oorspronkelijke voorste einde van de RNAi wormen is gericht aan de linkerkant. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2: Volgorde van de voeding en snijden cycli voor typische RNAi-protocol, bestaande uit meerdere voedingen (F), en regeneratieve cycli (x) die effectief is voor knockdown van vele genen in D. japonica. Wijziging van dit protocol voor individuele genen kan nodig zijn om optimale resultaten te leveren, bijvoorbeeld met behulp van een minder (tussen haakjes) of een groter aantal voeding en regeneratieve cycli.

<ol><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Entwm+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+patterns+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li>
<li>Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li>
<li>Newmark, P. A. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+needed+for+regeneration%2C+stem+cell+function%2C+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li>
<li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li>
<li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+the+central+nervous+system%3A+how+easy+for+planarians%21%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li>
<li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22A+Laboratory+Manual+Chapter%22%5BJournal%5D)">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li>
<li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians%3A+translations+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li>
<li>Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li>
<li>Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li>
<li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Hedgehog%2FPatched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li>
<li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li>
<li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2%2B+channel+beta+subunits%3A+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li>
<li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li>
<li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li>
<li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Djeyes+absent+%28Djeya%29+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li>
<li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+%28CNS%29+revealed+by+neuronal+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De protocollen die hier beschreven detail assays voor het bestuderen en manipuleren van de regeneratie van de planarian Dugesia japonica. Ze zijn eenvoudig en vereisen geen speciale apparatuur zodanig dat zij gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in het laboratorium of in de klas. Testen kan individueel worden uitgevoerd, of gecombineerd (voor de chemische genetische screening van het geneesmiddel efficacies in vivo) en kan worden uitgevoerd op de kandidaat-gen niveau, of zijn aan te passen aan onpartijdige, hogere throughput screening &#39;8. Of het nu voor het bestuderen van het intrigerende biologie van planarians in hun eigen recht, of voor het beoordelen in vivo functie van zoogdieren homologen in een alternatief model voor het bestuderen van weefselregeneratie, moeten deze benaderingen katalyseren belangstelling van een breed scala aan onderzoekers.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Verkoper </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Bronwater </td><td> Kandiyohi. Premium Waters Inc Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> Andere vormen van bronwater ook goed te werken. Trial eerst in levensvatbaarheid assays. </td></tr><tr><td> 1 x gebufferde Montjuich zouten: NaCl (1,6 mm), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0,1 mm), KCl (0,1 mm), NaHCO3 (1,2 mm), HEPES (1.5mm). pH 7,4 bij 24 ° C. </td><td> Meerdere leveranciers </td><td> n / a </td><td> Kunstmatig water voor behandeling met geneesmiddelen tijdens de regeneratieve assays om de pH buffering zorgen. 5 / 8 Holtfreter De oplossing is een alternatief. </td></tr><tr><td> 2xYT Broth </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Media = 31 g / L. Geautoclaveerd. </td></tr><tr><td> Petri Dish (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Woningen wormen tijdens de regeneratie cycli </td></tr><tr><td> Vierkante Dish (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 tot 757-11A </td><td> Vullen met water, te bevriezen voor ijs tray gebruikt als worm snijvlak </td></tr><tr><td> Kunststof kuip: Ziploc Twist &#39;n Loc (16oz). </td><td> Verschillende retailers </td><td> n / a </td><td> Handige waterdichte containers voor RNAi cohorten </td></tr><tr><td> Kippenlever </td><td> Commerciële boodschappen </td><td> n / a </td><td> Voorkeur voor organische levert, als gevolg van het vermijden van antibiotica. </td></tr><tr><td> Hand Blender </td><td> Elke keuken leverancier </td><td> n / a </td><td> Gebruik voor het maken van kippenlever puree </td></tr><tr><td> Wire Mesh zeef 1mm </td><td> Elke keuken leverancier </td><td> n / a </td><td> Gebruik voor het uitpersen van kippenlever puree </td></tr><tr><td> Van runderen rode bloedcellen </td><td> Lampire Biological Laboratories </td><td> 7240807 </td><td> 100% Gewassen en samengevoegd RBC schorsing </td></tr><tr><td> Circulaire papieren filters </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Transferpipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Steriel, chirurgische mesjes </td><td> Meerdere Leveranciers </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4668 </td><td> Bewaar poeder aliquots in het donker bij 4 ° C. Uitdrogen. </td></tr><tr><td> Dj-zes-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi positieve controle voor &quot;eye-less&quot; fenotype 23 </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> RNAi positieve controle voor twee-onder leiding fenotype 17 </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi positieve controle voor het verlies van lichtschuwheid fenotype 24 </td></tr></tbody></table>

farmacologische en functionele genetische testen om de regeneratie van de planarian manipuleren dugesia japonica</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Vrijlevende planarian platwormen hebben een lange geschiedenis van de experimentele gebruik door hun opmerkelijke regeneratieve capaciteiten 1. Kleine fragmenten uitgesneden uit deze dieren de hervorming van het oorspronkelijke bouwplan na herstel van het missen van het lichaam structuren. Bijvoorbeeld als een &#39;stam&#39; fragment is gesneden uit een intact worm, een nieuw &#39;hoofd&#39; naar voren zal regenereren en een &#39;staart&#39; zal achterzijde regenereren het herstellen van de oorspronkelijke &#39;head-to-tail&#39; polariteit van het lichaam structuren voorafgaand aan de amputatie (figuur 1A). Regeneratie wordt gedreven door planarian stamcellen, bekend als &#39;neoblasts&#39; die in ~ 30 verschillende celtypes differentiëren tijdens de normale lichaam homeostase en gehandhaafd weefselregeneratie. Deze regeneratieve proces is robuust en gemakkelijk aan te tonen. Door de inzet van een aantal baanbrekende laboratoria, vele tools en functionele genetische methoden zijn nu geoptimaliseerd voor dit model systeem. Derhalve heeft de laatste tijd veel vooruitgang geboekt in het begrijpen en manipuleren van de moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan planarian ontwikkelingsplasticiteit 2-9. Het planarian modelsysteem zal van belang zijn voor een breed scala aan wetenschappers. Voor neurowetenschappers, het model biedt de mogelijkheid om de herontwikkeling van een hele zenuwstelsel bestuderen, in plaats van simpelweg de hergroei / reparatie van enkele zenuwcel proces dat meestal de focus van onderzoek in tal van bestaande modellen. Planarians drukken een overvloed aan neurotransmitters 10, vormen een belangrijk systeem voor het bestuderen van de evolutie van het centrale zenuwstelsel 11, 12 en hebben gedragsproblemen screening van potentiële 13, 14. Regeneratieve uitkomsten vatbaar zijn voor manipulatie door farmacologische en genetische apparoaches. Kan bijvoorbeeld drugs worden gescreend voor de effecten op regeneratie simpelweg door het plaatsen van het lichaam fragmenten in drug-bevattende oplossingen op verschillende tijdstippen na amputatie. De rol van individuele genen kan worden bestudeerd met behulp van knock-down methoden (in vivo RNAi), die kan worden bereikt door cycli van micro-injectie of door het voeren van bacterieel-uiting dsRNA constructies 8, 9, 15. Beide benaderingen kunnen produceren opvallende fenotypes bij hoge penetrantie, bijvoorbeeld, de regeneratie van bipolaire dieren 16-21. Ter bevordering van de goedkeuring van dit model en de implementatie van dergelijke methoden, hebben we laten zien in deze video artikel protocollen voor farmacologische en genetische testen (in vivo RNAi door het voeren van) het gebruik van de planarian Dugesia japonica.

Een aantrekkelijk model voor het bestuderen van stamcellen differentiatie binnen een levend dier is de planarian platworm. Regeneratie wordt bestudeerd door eenvoudige amputatie experimenten die gemakkelijk worden uitgevoerd in een basic laboratorium en zijn vatbaar voor farmacologische en genetische (<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) manipulatie zoals beschreven door de protocollen in dit artikel.

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Vrijlevende planaria-platwormen hebben een lange geschiedenis van experimenteel gebruik vanwege hun opmerkelijke regeneratieve vermogens1. Kleine fragmenten die zijn uitgesneden uit ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is het uitvoeren van en manipuleren van regeneratieve assays in Parian platwormen met behulp van farmacologische en/of genetische knockdown-methoden. De eerste stap is het beheersen van de basisassay voor amputatie en regeneratie. Vervolgens wordt getoond hoe geneesmiddelen kunnen worden gebruikt om de regeneratieve polariteit te omkeren, bijvoorbeeld om dieren met twee koppen te verkrijgen.Tot slot wordt beschreven hoe in vivo RNAi via voeding kan worden uitgevoerd, om de effecten van functieverlies van specifieke genen te onderzoeken. De resultaten tonen aan dat behandeling met het geneesmiddel quintal de regeneratie ondermijnt, wat leidt tot tweekoppige wormen, en dat genetische knockdown van een betaine-isoform een nagenoeg identiek fenotype produceert.Hallo, mijn naam is John Chan, een promovendus in het marching laboratorium, en ik zal deze procedures demonstreren. Een visuele demonstratie van deze methoden is belangrijk, omdat geen enkele individuele stap op zichzelf moeilijk is. Een algehele demonstratie van deze technieken zal onderzoekers helpen die nieuw zijn met dit modelsysteem.Ter voorbereiding op de assay wordt een cohort van ongeveer 30 parian gedurende ten minste vijf dagen vóór de assay niet gevoerd. De worm moet op de dag van de assay tussen de 8 en 10 millimeter lang zijn. Spoel een vooraf genivelleerd ijsbakje af met water en dek het vlakke ijsoppervlak af met vershoudfolie met behulp van een pincet.Plaats één filterpapier op de vershoudfolie. Maak het filterpapier vochtig met een paar druppels bronwater met behulp van een transferpipet en plaats maximament 20 plin op het filter. Indien nodig kunnen de wormen op het filter worden herplaatst door opnieuw te pipetteren met meer bronwater.Zodra de wormen in positie zijn, verwijdert u overtollige vloeistof met een scalpel en amputeert u de kop door één snede te maken ongeveer halverwege de anterior apex van het dier en het anterieure uiteinde van de pharynx. Amputeer vervolgens het staartgedeelte door één snede te maken ongeveer halverwege het staartuiteinde van het dier en het posterieure uiteinde van de pharynx. Verwijder na het snijden overtollig slijm van de scalpel met een papieren handdoek bevochtigd met 70% ethanol, en veeg daarna het overtollige ethanol van de scalpel af voordat u opnieuw snijdt.Pak het filter met een pincet op en breng het over in een Petrischaal met springwater. Wacht ongeveer drie minuten tot de wond is gesloten, wat waarneembaar is door een samentrekking en verdonkering van de wond. Spoel de stamfragmenten van het filterpapier in een Petrischaal met het gewenste medium voor de regeneratie-assay en breng deze over naar een thermostaatincubator die is ingesteld op 24 graden Celsius.Beoordeel het regeneratieve fenotype na ongeveer één week. Wanneer geregenereerde structuren identificeerbaar zijn, bereid dan een 200 millimolaire quintal of PZ Q-voorraadoplossing door het geneesmiddel op te lossen in DMSO voor vers gebruik op dezelfde dag. Maak vervolgens 50 milliliter van de drughoudende oplossing door 22,5 microliter van de PZ Q-voorraadoplossing toe te voegen aan gebufferde majic salts en vortex dit gedurende ongeveer één minuut.Om dispersie te garanderen, worden de wormen op filterpapier geplaatst dat is bevochtigd met bronwater, waarna zowel de kop als de staartregio worden geamputeerd zoals beschreven in de regeneratie-assay voor fragmentatie van de romp. Na de amputatie en wondsluiting worden de rompfragmenten overgebracht naar een Petrischaal met bronwater. Vervang het medium door een 90 µM PZ Q-oplossing en plaats de Petrischaal in de incubator bij 24 °C. Na 24 tot 48 uur wordt het medium dat PZ Q bevat vervangen door bronwater, waarbij de worm meerdere keren wordt gewassen. Plaats de wormen terug in de incubator en beoordeel na één week het fenotype van bipolariteit of tweekoppigheid van de wormen voorafgaand aan de assay.Bereid een homogenizaat van kippenlever door de vettige, geelgekleurde delen uit de voorraad te verwijderen en de resterende lever vervolgens te pureren. Filtreer de puree door een zeef en bewaar de resulterende suspensie. Bereid vervolgens runderrode bloedcellen (erytrocyten) voor door de voorraad te aliquoteren in monsters van 1 mL, die worden bewaard bij -20 °C.Gebruik wormen die vijf dagen zijn uitgehongerd en verdeel deze in drie cohorten. Het gen van belang, een positieve controle (een gen met een bekend RNAi-fenotype) en een negatieve controle (een gen zonder RNAi-fenotype).Gebruik voor elke cohort ongeveer 250 wormen met een lengte van 8 tot 10 millimeter. Ontdooi voor elke cohort een voorraad e coli die dubbelstrengs RNA tot expressie brengt, gericht op de genen van belang, samen met een buisje kippenleverhomogenaat en een buisje RBC's. Pelleteer de bacteriën door centrifugatie bij 13.000 Gs gedurende één minuut, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 700 µL twee XYT-medium.Centrifugeer opnieuw, gooi het supernatant weg en plaats het pellet vervolgens op ijs. Maak een P 200 pipetpunt met een grote opening door de punt af te knippen; resuspendeer het bacteriële pellet vervolgens grondig in 150 µL kippenleverhomogenaat plus 50 µL RBC's om een RNAi-voedingsmengsel te maken. Verwijder luchtbellen door een korte centrifugeerpuls voor het voeren.Verwijder het grootste deel van het water uit de plastic bak met wormen, zodat er een diepte van ongeveer één inch overblijft. Draai de bak rond om de wormen in het midden van deze container te concentreren. Pipetteer vervolgens het RNAI-voedingsmengsel in een cirkel om de wormen naar binnen te drijven.Gebruik een transferpipet om eventuele ontsnapte wormen voorzichtig terug in het RNAi-voedingsmengsel te leiden zonder de andere etende wormen te storen. Identificeer na ongeveer een uur voeden de wormen die goed hebben gegeten en verwijder alle wormen die niet goed gevoed lijken. Goed gevoede wormen vertonen een dieprode kleur door de ingenomen RBC's.Vervang de voedingsoplossing voorzichtig door vers bronwater, waarbij u erop lets dat de verstoring tot een minimum wordt beperkt om opname van voedsel te voorkomen. Om dit te doen, lokaliseert u de wormen voorzichtig aan één zijde van de bak met behulp van een overdrachtspijp. Giet het troebele water af en vervang dit voorzichtig door vers water dat langs de tegenovergestelde wand van de bak wordt gegoten, zodat de dieren snel weer ondergedompeld worden om langdurige blootstelling aan lucht te vermijden.Dit resulteert ook in een globale voedselinname. Sluit het deksel van de container en plaats de wormen terug in de incubator van 24 graden Celsius. Herhaal dit RNAi-voerprotocol over meerdere cycli, afgewisseld met regeneratiecycli, om uiteindelijk te screenen op RNAi-fenotypes.Hier wordt een standaard schema voor voeding en regeneratie getoond dat effectief is voor veel genen. F staat voor het voedingsprotocol en X staat voor de regeneratie-assay. In totaal duurt het protocol ongeveer een maand en het kan worden aangepast voor verschillende genen door minder voedingen (weergegeven tussen haakjes F) of meer voedingen op te nemen, aangezien het optimale protocol afhankelijk zal zijn van factoren zoals mRNA-stabiliteit, weefsel lokalisatie, eiwit, P dur, of de ontwikkeling van een fenotype dat meerdere voedingscycli na regeneratie verhindert.Hier zijn resultaten die typisch zijn voor de assay voor rompregeneratie. Links is een parian te zien boven een schema dat de amputatiesneden aangeeft. Rechts is een tijdlijn te zien van de regeneratie van het rompfragment die over zeven dagen plaatsvindt, waarbij oogvlekken rond dag drie verschijnen.Hier is de farmacologische ondermijning van regeneratie van rompfragmenten door PZ Q.behandeling, waarbij tweekoppige wormen zijn verkregen met behulp van RNAi tegen het gen DJ 61. In een FX FX voedingsprotocol resulteert dit in een ilis-fenotype; het verlies van een lichtafstotingsrespons na een FFFX voedingsprotocol resulteert in immobiele DJ PC twee RNAi-wormen, die rood zijn gekleurd in vergelijking met de mobiele controle. Wormen die groen zijn gekleurd, vertonen een RNAi-knockdown van DJ beta catine in één exemplaar.Het gebruik van een FXFX-voerprotocol resulteert in de regeneratie van een kop vanuit de posterieure wond. Na het volgen van deze procedures zullen onderzoekers in staat zijn om genen die relevant zijn voor hun onderzoek te targeten, gebruikmakend van knockdown-methoden of selectieve farmacologische agentia, om hun rol in de biologie van de parian en weefselregeneratie te onderzoeken.

pharmacological-functional-genetic-assays-to-manipulate-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe C. elegans te gebruiken om dopaminerge neuron neurodegeneratie te beoordelen als een model voor de ziekte van Parkinson. Verder worden genetische screens gebruikt om de factoren die een verbetering van degeneratie of neuroprotectieve identificeren.

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.

Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

Benaderingen voor het testen van de effecten van antipsychotica (APD) in Caenorhabditis elegans worden gedemonstreerd. Assays zijn beschreven voor het testen van geneesmiddelen effecten op de ontwikkeling en de levensvatbaarheid en keelholte pompsnelheid. Deze methoden zijn ook van toepassing voor farmacogenetisch experimenten met andere dan APD drugklassen.

Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

De planarian Schmidtea mediterranea is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcellen en weefselregeneratie. Deze publicatie beschrijft een methode om selectief verwijderen van één orgaan, de keelholte, door dieren naar de chemische natriumazide bloot te leggen. Dit protocol wordt ook uitgelegd welke methoden voor de controle van de keelholte regeneratie.

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Planaire beweeglijkheid wordt gebruikt om de stimulerende en ontwenningseigenschappen van natuurlijke producten te meten in vergelijking met de beweging van de dieren in bronwater alleen.

Een planaire beweeglijkheidstest om de biomodulating eigenschappen van natuurlijke producten te meten

Zoetwaterplanariërs vertonen drie gangen (glijden, peristaltiek en scrunching) die te onderscheiden zijn door kwantitatieve gedragsanalyse. We beschrijven een methode om scrunching te induceren met behulp van verschillende schadelijke stimuli, kwantificering daarvan, en onderscheid van peristaltiek en glijden. Met behulp van gen knockdown, tonen we de specificiteit van scrunching als een kwantitatieve fenotypische uitlezing.

Planarian Scrunching als een kwantitatieve gedragsuitlezing voor schadelijke stimuli sensing

Dit protocol presenteert de stappen die zijn genomen om de eierstokken in de zoetwaterplanariërs, Schmidtea mediterranea,  te ontleden.De ontlede eierstokken zijn compatibel voor immunokleuring van antilichamen en ultrastructurele analyse met transmissie-elektronenmicroscopie om de celbiologie van de eicellen en somatische cellen te bestuderen, waardoor een beeldvormingsdiepte en -kwaliteit worden geboden die voorheen ontoegankelijk waren.

Planaire ovariumdissectie voor ultrastructurele analyse en kleuring van antilichamen

Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van chemisch geherprogrammeerde stamcellen om nauwkeurige neuronale modulatie te bereiken door deze cellen te differentiëren in dopaminerge voorlopercellen, ze te transplanteren in muismodellen van de ziekte van Parkinson en gedrags- en elektrofysiologische resultaten te evalueren om de succesvolle integratie en functionele effectiviteit van de getransplanteerde cellen te bevestigen.

Chemogenetische regulatie in geherprogrammeerde stamcel-afgeleide voorlopercellen bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten

Leer regeneratie-assays manipuleren bij planaria door farmacologische en genetische methoden toe te passen. Deze technieken helpen onderzoekers stamceldifferentiatie en regeneratieve biologie bestuderen.

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica

Meer video's verkennen