Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding

Het algemene doel van deze procedure is om een steroidreceptor-HSP 90-eiwitcomplex biochemisch te reconstitueren en de ligandbindende activiteit van de steroidreceptor te reactiveren, wat kan worden gebruikt om de cofactor-vereisten van HSP 90 en de effecten van het toevoegen van exogene verbindingen aan het reconstitutieproces te testen. Dit wordt bereikt door eerst celcytosol voor te bereiden dat functionele glucocorticoïdreceptoren bevat. Vervolgens wordt de GR uit het celcytosol immuuno-geadsorbeerd en endogeen.

HSP 90 wordt gedissocieerd. Vervolgens wordt het GR HSP 90-heterocomplex gereconstitueerd met behulp van een exogene bron van HSP 90 en andere chaperone-eiwitten en cofactor-eiwitten. Ten slotte worden de gereconstitueerde eiwitcomplexen en de ligandbindingsactiviteit geanalyseerd; specifiek worden methoden zoals SDS-PAGE, western blotting en radioactieve ligandbindingsassays gebruikt om de vorming van het GR HSP 90-heterocomplex en de steroidbindingsactiviteit aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de HSP 90 moleculaire chaperone, zoals welke cofactor-chaperones en COS-chaperones vereist zijn om de functionele activiteit van HSP 90 te faciliteren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitvouwing, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de ontwikkeling van HSP 90-afhankelijke leadverbindingen en de analyse van intracellulaire signaleringspaden waarvoor HSP 90 nodig is. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hannah Franklin en Nathan Forawa, twee onlangs afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium. Om functionele glucocorticoïdreceptor of GR te isoleren, kweekten we muizenfibroblast L 9 29-cellen of SF nine-cellen die zijn geïnfecteerd met recombinant GR-baculovirus en zich in de exponentiële groeifase bevinden. Centrifugeer de celsuspensie bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.

De resulterende pellet moet een volume van ongeveer één tot vijf milliliter hebben. Was de celpellet drie keer met 15 milliliters Hank's gebufferde zoutoplossing. Bereid 1,5 volumes homogenisatiebuffer bestaande uit HEM-buffer, één millimolar fenylmethylsulfonylfluoride of PMSF en drie complete mini protease-remmertabletten, vermalen met 50 slagen van een vijzel.

De homogenisator brak de cellen open; deze stap werd op ijs uitgevoerd om proteïnedegradatie te voorkomen. Centrifugeer het homogenaat in een ultracentrifuge bij 100.000 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verdeel het supernatant dat het cytosol bevat in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes van elk 500 microliters en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius.

Om een mengsel voor te bereiden dat een monoklonaal IgG-antilichaam bevat dat is opgewekt tegen de receptorspecifieke GR, combineer 100 µL ontdooid GR-bevattend cytosol, 200 µL TEGM-buffer, 100 µL van een 20% proteïne A-sepharose of PAS-slurry en vijf µg van een anti-G monoklonaal IgG-antilichaam, zoals Bugger 2. Vanwege de relatief grote PAS-beadgrootte.

Gebruik een afgeknipt P 200 pipetpuntje om PAS over te brengen van de 20%slurry naar monsterbuisjes. Plaats de monsters op een verticaal draaiend wiel en incubeer ze gedurende minimaal twee uur bij constante rotatie. Verwijder vervolgens de ongebonden eiwitten uit het antilichaam PAS-pellet door de monsters één minuut te centrifugeren in een gekoelde centrifuge.

Was de pellet bij 10.000 Gs twee keer door één milliliter TEGM-buffer toe te voegen, te vortexen en vervolgens te centrifugeren. Verwijder de laatste wasbeurt met een gekrimpte P 200 pipetpunt om endogeen HSB 90 van de GR-immunopellet te dissociëren en voeg 355 microliter TEG-buffer en 45 microliter vijf molar natriumchloride toe aan het antilichaam. PAS-pellet vooraf bereid.

Plaats de monsters op een verticaal draaiend wiel en laat deze anderhalf uur incuberen onder constante rotatie. Verwijder de ongebonden eiwitten uit het immunopellet door deze één minuut te centrifugeren bij 10.000 Gs. Was de pellets één keer met één milliliter TEG-buffer en één keer met één milliliter 10 millimolaire HEPES-buffer pH 7,4. Verwijder het wasmiddel met een gecrimpte P 200 pipetpunt, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat het pellet wordt verstoord.

Om het GR HSB 90 hetero-complex te reconstitueren, voegt u aan het pellet een mengsel toe bestaande uit 50 microliters van een bron van moleculaire chaperonnes, zoals een konijnenreticulocyt-lysaat, en vijf microliters van een ATP-genererend systeem. Deze volgende stap is cruciaal om een adequate menging van het pellet en de reconstitutie-oplossing te waarborgen. Incubeer de monsters precies 20 minuten in een waterbad van 30 degree Celsius.

Tik elke één tot twee minuten tegen de buisjes om het pellet voorzichtig los te maken en de reconstitutie-oplossing te mengen. Voeg 1 mL TEGM-buffer toe, vortex en centrifugeer 1 minuut bij 10.000 Gs. Verwijder het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet wordt verstoord.

Herhaal de wasstap nog twee keer om eiwitten in het gereconstitueerde pellet te identificeren. Bereid de monsters voor op elektroforese door 50 µL SDS-PAGE-monsterbuffer met betta-mercaptoethanol toe te voegen. Meng de monsters en incubeer deze vervolgens vijf minuten in een kokend waterbad of in een elektronisch warmteblok van 100 °C.

Centrifugeer de monsters bij 10,000 Gs gedurende één minuut. Gebruik het supernatant van deze monsters voor SDS-PAGE of microfluïdische elektroforese gevolgd door een western blot. Het gebruik van een P 200 crimped tip bij het laden van het supernatant beperkt het risico op het per ongeluk opzuigen van het pellet.

De volgende stap is het analyseren van het GR HSP 90-eiwitcomplex op steroidbindende activiteit. Voeg, met gebruik van een getritieerd steroid, 47,5 µL HEM-buffer en 2,5 µL 2 µM getritieerde dexamethason toe aan het gereconstitueerde immunopellet.

Meng het pellet voorzichtig, waarbij u er op let dat er zo min mogelijk monster tegen de wand van de microcentrifugebuis terechtkomt. Incubeer het monster een nacht ongestoord op ijs. Voeg één milliliter TEGM-buffer toe, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende één minuut bij 10, 000 GS.

Giet het supernatant voorzichtig weg. Het bevat ongebonden getritieerd steroïde; herhaal dit in totaal drie keer met TEGM-buffer volledig. Verwijder al het supernatant aan het einde van de laatste wasbeurt.

Gebruik een geknikte P 200 pipetpunt. Suspendeer de gewassen immunopellets in 200 µL TEGM-buffer en breng deze over naar 10 mL scintillatieflacons.

Voeg 4,8 milliliter scintillatiecocktail toe aan de vials en vortex deze. Voer vervolgens vloeibare scintillatiespectrometrie uit; representatieve SDS-PAGE- en western blot-gegevens zijn hier weergegeven in deze kumasi-gekleurde gel. Het endogene GR HSB 90 hetero-complex is geimmunoassay-geabsorbeerd uit het cytosol van de cel met behulp van anti-GR-antilichamen, en de individuele eiwitten die samen met GR zijn geabsorbeerd, zijn gevisualiseerd.

Hier zijn de microfluïdische elektroforesegegevens van Experian die gereconstitueerde GR HSP 90 heterocomplexen weergeven. De specificiteit van de GR-immunoabsorptie wordt bevestigd door het absorberende anti-GR-antilichaam van de immuno-adsorptie te vervangen door een niet-immuun antilichaam, zelfs wanneer er overmatige hoeveelheden worden gebruikt. Er worden geen GR of moleculaire chaperonnen immunoprecipiteerd.

Hetzelfde geldt voor de bevestiging van de dissociatie van HSP 90 en andere chaperone-eiwitten van de met zout gestripte GR via western blotting van de gestripte en gereconstitueerde immunopellets. De zware keten van het immuno-absorberende antilichaam is detecteerbaar met zowel Coomassie-kleuring als western blotting, wat bevestigt dat in elke lane gelijke hoeveelheden immunopellets worden gevisualiseerd. Representatieve gegevens over de steroïdbindende activiteit van de immuno-absorptieve GR worden hier gepresenteerd met gebruik van respectievelijk reticulocytenlysaat of gezuiverde eiwitten.

De steroïdebindingsactiviteit van het gereconstitueerde GR HSB 90 hetero-complex keert doorgaans terug naar 75 tot 100% van het niveau van de endogene GR HSB 90 bindingsactiviteit. Vergelijkbaar met de elektroforesegegevens kan een niet-immuun antilichaam in plaats van het anti-GR-antilichaam worden gebruikt als negatieve controle en als maat voor niet-specifieke binding van getritieerde steroïden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals 2D-gelelektroforese, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke impact post-translationele modificaties van HSP 90 hebben op de reconstitutie van het hetero-complex en de steroïdebinding. Reconstitutie-assays, zoals die hier worden beschreven, hebben onderzoekers in staat gesteld de functionele betekenis van de op HSP 90 HSP 70 gebaseerde MultiPro-chaperonne-machinerie en de stapsgewijze assemblage ervan te onderzoeken, waarbij de glucocorticoïde receptor als model-HSP 90-cliëntprotein werd gebruikt.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u functionele glucocorticoidreceptor-HSP 90-eiwitcomplexen kunt prepareren uit gezuiverde eiwitten in cellulaire lysaten. De gebruikte stappen omvatten het prepareren van GR-bevattend cellysaat, immuunabsorptie van de receptor, salt stripping van de endogene eiwitten en reconstitutie van het heterocomplex met behulp van exogene HSP 90, HSP 70-cofactoren en co-chaperonnes.