Name: Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor het selecteren van optimale hydrofobe interactiechromatografie-kolommen voor eiwitzuivering met een medium-druk vloeistofchromatografiesysteem. Deze aanpak vermindert variabiliteit en garandeert reproduceerbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health subsidie ​​GM086822 en National Science Foundation grote onderzoeksprojecten instrumentatie subsidie ​​DBI-0960313. De auteurs willen graag Drs bedanken. Jon Miyake &amp; Donna Hardy (Bio-Rad) en Jennifer Loertscher (Seattle University) voor hun technische expertise. Selecteer chromatografie reagentia en aanvullende instrumenten werden rijkelijk verzorgd door Bio-Rad.

<ol><li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li>
<li>Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+modeling+of+nonlinear+hydrophobic+interaction+chromatographic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).</li>
<li>To, B. C., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins.+IV.+Protein+adsorption+capacity+and+transport+in+preparative+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).</li>
<li>Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+mild+hydrophobic+interaction+chromatography+for+%22method+scouting%22+protein+purification+strategies+in+aqueous+two-phase+systems%3A+a+study+using+model+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins.</a> Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).</li>
<li>Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+proteins+in+receptor+research%3A+an+emerging+tool+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).</li>
<li>Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.A+Protocol+for+the+Production+of+KLRG1+Tetramer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer.</a> J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+Magnetosome+Associated+Protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41.</a> J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automatic+system+for+multidimensional+integrated+protein+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).</li>
<li>Camper, D. V., Viola, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fully automated protein purification.</a> Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).</li>
<li>Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+green+fluorescent+protein+screen+for+identification+of+well-expressed+membrane+proteins+from+a+cohort+of+extremophilic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms.</a> Protein Sci. 18, 121-133 (2009).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).</li>
<li>Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins.</a> J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).</li>
<li>McCue, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+use+of+hydrophobic+interaction+chromatography+in+protein+purification+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications.</a> Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).</li>
</ol>

Selecteer chromatografie reagentia en aanvullende instrumenten werden verzorgd door Bio-Rad.

Vloeistofchromatografie technieken hebben bewezen van onschatbare waarde voor het bereiden van zeer zuivere eiwitten die nodig zijn voor het uitvoeren van immunologische 6, biochemische 7, 8 en structurele studies. HIC zuiveringsmethoden meest vaak empirische bepaling van een voorkeursuitvoeringsvorm medium en ligand structuur ligand dichtheid en matrix kraal eigenschappen allemaal aangetoond chromatografische resultaten 2, 3 beïnvloeden. Automatische kolom scouting is een efficiënte aanpak voor het selecteren van een HIC medium voor de daaropvolgende optimalisatie en eiwit zuivering 4. De automatische kolom weergegeven scouting methode kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende HIC eiwitzuivering strategieën. Veranderingen in zoutconcentratie, de keuze van zout, zout gradiënt, en pH kan verder toenemen zuivering voorwaarden, en de effecten van verschillende deze essentiële parameters zijn eerder beoordeeld 13,14. HIC eluaat met een gedeeltelijk gezuiverd doel protein kan verder worden gezuiverd met een complementaire chromatografische technieken zoals ionenuitwisselingschromatografie (IEX) of gelfiltratie / gelpermeatiechromatografie 9,10. Door zijn unieke lichtabsorptie en de emissie-eigenschappen kan de elutie profiel van GFP worden geïdentificeerd met behulp van in-line en post-run benaderingen. Daartoe kan dit protocol verder worden aangepast voor het zuiveren van recombinant GFP-fusie-eiwitten, waarbij een onafhankelijke doelwit eiwit &quot;tag&quot; met GFP. GFP-gelabeld doelwit eiwitten kunnen worden gedetecteerd met UV licht 11 en gezuiverd met verschillende chromatografische methoden, zoals de HIC zuivering strategie hierboven beschreven. GFP zuivering heeft ook een pedagogische nietje in de biochemie labs voor het onderwijs van de moderne wetenschap eiwit technieken 12. Terwijl de basis HIC eiwit zuivering kan worden uitgevoerd met behulp van een aanzienlijk minder robuust chromatografie systam, de apparatuur hier gepresenteerde een aantal duidelijke voordelen om te helpen bij het verkrijgen van gunstige resultaten. Opmerkelijke voordelen van het gebruik van een sterk geautomatiseerd zijn: verbeterde run-to-run conditie reproduceerbaarheid, tijdwinst en een verminderde kansen op luchtvervoer in te voeren in het systeem 10. Systeem gecontroleerde buffer mengen wordt vergemakkelijkt door het systeem maximizer, maakt grotere consistentie in buffer bereiding en experimentele reproduceerbaarheid. Tekening voldoende monster last in de dynamische monsterlus voor scouting loopt verder verzekert uniformiteit van het monster worden toegevoegd aan elke kolom en maakt opeenvolgende zonder onderbreking of handmatig opnieuw. Gecontroleerde injecteren van een monster van het monster lus op de kolom af variabiliteit die zich kunnen voordoen met de hand sample laden. Een paar kolomselektiemiddelen kleppen kunnen voor opeenvolgende monsters runs, die elk een eigen HIC kolom zonder het systeem replumb. Het uitvoeren van mul<html> ti-golflengte-analyse is bijzonder gunstig bij het testen een eiwit met een unieke spectrofotometrische profiel. Naast GFP kan cytochromen, flavoproteins en andere heem-bevattende eiwitten voordeel van deze techniek. Geleidbaarheid en pH-meting apparaten kunnen voor de verificatie van real-time experimentele omstandigheden. Split fractie eluaat collectie zorgt voor een betere handling fractie en maakt een eenvoudige overdracht voor post-run analyse methoden die een minimaal monstervolume (bijv. ELISA, SDS-PAGE, western blot, en Experion microfluïdische elektroforese) vereisen. Tijdens het bedienen van de tweede fractie collector offline vereist handmatige synchronisatie, het zorgt voor maximale flexibiliteit in de fractie collector selectie. De belangrijkste nadelen aan het gebruik te maken van een dergelijk robuust chromatografie systeem voor het HIC kolom scouting en eiwit zuivering zijn de eerste tijd en budgettaire uitgaven aan de akte aankoop en de opleiding. t &quot;&gt; Het protocol die hier gebruikt een Bio-Rad DuoFlow chromatografie systeem;. echter even sterk instrumentatie andere fabrikanten zoals de Akta Avant van GE Healthcare, kunnen ook worden gebruikt en kunnen die gelijkwaardige resultaten Ook vergelijkbaar chromatografiesysteem hebben unieke kenmerken (bijv. methode programmering, het onderdeel nomenclatuur, de voorkeuren en schaalbaarheid beperkingen) dat moet worden overwogen alvorens een zuivering procedure of instrument acquisitie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 Systeem</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Inclusief systeem Maximizer, mixer, F10 werkstation, AVR7-3 ventiel, QuadTec UV / Vis detector met stroom cel, BioFrac fractiecollector, BioLogic software en starter kit </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">Avr9-8 stream-klep te selecteren</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> Hogedruk klep 9-poort 8-positie, 3500 psi (233 bar) limiet voor gebruik met BioLogic DuoFlow systeem </td></tr><tr><td> Omschakelklep SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Magneetventiel, 3-poort, 2-positie, 30 psi (2 bar) limiet, voor gebruik met biologische DuoFlow systeem </td></tr><tr><td> Stroom splitter ventiel </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tische = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Sliding-zuiger sample loop kit, bevat 25 ml DynaLoop schuiven zuiger lus, DynaLoop onderdelen kit (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFrac Fraction Collector</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Twee fractie col<html> lectoren gebruikt </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac microplaat Drop Head-adapter</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac microtiterplaat-adapter</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = US &amp; lang = nl &amp; ProductID = 741-0017 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV-Optics module</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Halogeen lamp</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> een target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Gradient Pomp</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> gradiënt pomp voor lage druk eiwitzuivering, omvat buizen en fittingen van set </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion System</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = 224301 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 Analysis Kit</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap HIC kolom selectie kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Inclusief 7 x 1 ml voorverpakte kolommen van HIC media voor scouting </td></tr><tr><td> GE Healthcare-to-Bio-Rad kolom fittingen </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 en 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie kolomselectieopties voor gebruik in protein purification

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In tegenstelling tot andere chromatografische methoden voor het zuiveren eiwitten (bijv. gelfiltratie, affiniteit en ionenwisseling), hydrofobe interactie chromatografie (HIC) vereist vaak experimentele bepaling (hierna screening of &quot;scouting&quot;) om de meest geschikte chromatografische medium selecteren voor reinigen van een bepaald eiwit 1. De hier beschreven werkwijze beschrijft een automatische benadering scouting voor een optimale HIC media worden gebruikt eiwitzuivering. HIC scheidt eiwitten en andere biomoleculen van een ruw lysaat gebaseerd op verschillen in hydrofobiciteit. Net affiniteitschromatografie (AC) en ionenuitwisselingschromatografie (IEX) HIC kan concentreren het eiwit van belang omdat vordert in de chromatografisch proces. Eiwitten meest geschikt voor zuivering door HIC omvatten die met hydrofobe oppervlaktegebieden en in staat om te weerstaan ​​aan concentraties van meer dan 2 M ammo zoutnium sulfaat ((NH4) 2 SO 4). HIC wordt vaak gekozen als zuiveringsmethode voor eiwitten ontbreken een affiniteit tag, en dus niet geschikt voor AC en wanneer IEX niet in slaagt om voldoende zuivering. Hydrofobe resten op het eiwitoppervlak tijdelijk binden aan een niet-polair ligand gekoppeld met een inert, onbeweeglijk matrix. De interactie tussen eiwit en ligand zijn sterk afhankelijk van de zoutconcentratie van de buffer die door de chromatografiekolom met hoge ionische concentraties versterken eiwit-ligand interactie en waardoor het eiwit onbeweeglijke (bijvoorbeeld gebonden in de kolom) 2. Zoals zoutconcentraties afname het eiwit-ligand interactie verdwijnt het eiwit wordt weer mobiele elueert van de kolom. Verschillende HIC media zijn commercieel beschikbaar in voorverpakte kolommen, die elk een van de hydrofobe liganden (bijv. S-butyl, butyl, octyl, en fenyl) verknoopt op verschillende dichtheden agarose kralen van een specIFIC diameter 3. Automatische kolom scouting zorgt voor een efficiënte aanpak te bepalen welke HIC media moeten worden gebruikt voor toekomstige, meer volledige optimalisatie experimenten en eiwit zuivering loopt 4. De specifieke eiwit dat hier is gezuiverd recombinant green fluorescent protein (GFP), maar de benadering kan worden aangepast voor zuiveren van andere eiwitten met een of meer hydrofobe oppervlaktegebieden. GFP dient als nuttige modeleiwit, vanwege zijn stabiliteit, unieke lichtabsorptie piek bij 397 nm, en fluorescentie bij blootstelling aan UV-licht 5. Bacteriële lysaat met wild type GFP werd bereid in een hoge-zout buffer, geladen in een Bio-Rad DuoFlow medium onder druk vloeistof chromatografie systeem en geadsorbeerde HiTrap HIC kolommen die verschillende HIC media. Het eiwit werd geëlueerd van de kolom en geanalyseerd door in-lijn-en post-run detectiemethoden. Buffer mengen, dynamische monsterlus injectie, sequentiële colgegevensinvoerkolom selectie meerdere golflengte analyse en split fractie eluaat verzameling verhoogd werking van het systeem en reproduceerbaarheid van de experimentele benadering.

Een automatische methode om geschikte hydrofobe interactie chromatografie (HIC) media te gebruiken in het proces van eiwitzuivering gepresenteerd. De werkwijze maakt gebruik van een medium-druk vloeistof chromatografie systeem met automatische buffer mengen dynamische monsterlus injectie opeenvolgende kolomselektiemiddelen, multi-golflengte analyse en split fractie eluaat collectie.

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

In tegenstelling tot andere chromatografische methoden voor het zuiveren van eiwitten (bijv. gelfiltratie, affiniteits- en ionenaustauschchromatografie), hydrophobic interaction ...

Het algemene doel van deze procedure is het selecteren van een optimale HI-vloeistofchromatografiekolom met behulp van een geautomatiseerde scoutingmethode voor de zuivering van een recombinant eiwit met een BioRad DUO flow medium pressure vloeistofchromatographiesysteem. Dit wordt bereikt door eerst de benodigde buffers en bacteriële lysaten te bereiden die het betreffende recombinante eiwit bevatten. Vervolgens wordt het duo flow chromatographiesysteem fysiek opgezet, aangesloten en voorbereid voor het scoutingprotocol.Vervolgens worden de monsters geladen en wordt de geprogrammeerde HI-kolomscoutingmethode uitgevoerd om de fractie-monsters van de EIT te verzamelen. Ten slotte wordt de EIT geanalyseerd en worden de optimale HI-kolom en het medium geïdentificeerd op basis van de waargenomen scheidingskenmerken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een voorkeursmedium voor de HI-kolom aanduiden voor de opgeschaalde zuivering van het eiwit van belang van de onderzoeker via medium-druk vloeistofchromatografie, gebruikmakend van de geautomatiseerde HI-kolomscoutingmogelijkheden van de DUO flow.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals opeenvolgende runs van handmatige kolomchromatografie, is dat automatisering van het proces de variabiliteit vermindert en zeer reproduceerbare resultaten garandeert. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de fysieke complexiteit van moderne vloeistofchromatografiesystemen. Dit kan echter gemakkelijk worden onder de knie gekregen.Na voldoende oefening zullen Orange Stone en Shelly Anderson, twee studenten uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren. Bereid ter start 500 milliliter van de volgende buffers: 200 millimolair natriumfosfaat voor buffer A1, 200 millimolair natriumwaterstoffosfaat voor buffer A2 en 4,8 molair ammoniumsulfaat voor buffer B2; gedeïoniseerd water dient als buffer B1. Ontgas de buffers om optimale chromatografische bedrijfsomstandigheden te waarborgen. De systeemmaximizer zal buffers A1 en A2 mengen om een fosfaatelutiebuffer met een laag zoutgehalte te genereren, en zal buffers B1 en B2 mengen om het ammoniumsulfaat met een hoog zoutgehalte te genereren.Startbuffer. Bereid 20 milliliter monster ter belading door 10 milliliter cellysaat bevattende het te zuiveren eiwit te mengen met 10 milliliter buffer B twee. De uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van de cellysaatmonsteroplossing moet ongeveer 2,4 molar zijn, waardoor deze nagenoeg gelijk is aan de startbuffer.Filter het mengsel van lysaatbuffer door een spuitfilter van 0,45 micrometer met lage eiwitbinding om vaste deeltjes uit de oplossing te verwijderen. Bewaar het monster op ijs totdat het klaar is om in het systeem te worden geladen. De fysieke opstelling en de leidingen van het chromatografiesysteem vormen een van de meest complexe aspecten van deze procedure.Stel het duo-flow chromatographiesysteem in volgens het hier getoonde diagram. Zorg dat er voldoende volumes buffer beschikbaar zijn voor het gehele protocol en dat de slangjes ondergedompeld blijven. Sluit de monsterlaadklep en de dynamische monsterloop aan zoals hier geïllustreerd, en verbind de monsterloop met de monsterklepinlaat op positie drie.Bereid acht identiek formaat paren PEEK-buisjes voor met een buitendiameter van 1/16 inch. Verbind vervolgens de paren met posities één tot en met acht van de twee kolomselectiekleppen. Nadat de lampen van de UV-detector zijn ingeschakeld en is bevestigd dat alle detectoren zijn gekalibreerd, bevestigt u de stroomsplitterklep en de splittercontroller van de fractiecollector zoals hier afgebeeld.De splitklaap van de fractiecollector op positie twee en de splitcontroller worden offline van het chromatografiewerkstation bediend. Stel de splitpercentage in op 10. Vervang de standaard drophead van de fractiecollector op positie twee door een microplate-drophead.Spoel de monsterlus en spoel het chromatografiesysteem door. Start vervolgens een handmatige flow van 1 mL/min evolutiebuffer door het systeem. Verbind High Trap HI-kolommen van 1 mL met posities twee tot en met acht van de kolomselectieventielen.Verwijder de koppeling die de selectiekleppen voor kolompositie twee verbindt. Bevestig de fittingen van de stroomopwaartse kolom aan de duo flow. Laat de elutiebuffer door de fittingen stromen totdat alle lucht is verdreven en er een grote druppel buffer aanwezig is.Verwijder vervolgens de stop die verbonden is met de kolomingang en breng een grote druppel buffer met een laag zoutgehalte aan op de bovenkant van de kolom. Bevestig de kolom daarna aan de stroomopwaartse koppelingen. Sluit de uitgang aan op de stroomafwaartse kolomkoppelingen en de slangen van de selectieklep.Stel de tegendruklimiet in op 40 PS.I. Was de kolom met vijf kolomvolumes elutiebuffer bij een stroomsnelheid van 1 ml/min. Was de kolom vervolgens met 10 kolomvolumes startbuffer bij een stroomsnelheid van 1 ml/min.Zodra de pH- en UV-registraties en de tegendruk zijn gestabiliseerd, schakelt u de kolomselectieventielen handmatig naar positie één en stopt u de bufferstroom. Om een monster te laden, dompelt u de monsterinlaatslang in het monster van 20 milliliter. Schakel vervolgens het monsterloop-laadspoelventiel naar positie één en het monsterlaadventiel naar spoelen.Activeer de monsterlus-laadpomp, waarbij het monster met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut in de pompslangen wordt opgezogen tot het monster net het monsterlaadventiel heeft bereikt. Zet het monsterlaadventiel van purgeren naar laden. Start de monsterlus-laadpomp opnieuw met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut totdat er 10 ml monster in de dynamische monsterlus is getrokken via het instellingsvenster in de biologische software.Selecteer de systeemapparaten die in deze tabel met een asterisk zijn gemarkeerd. Selecteer vervolgens zes HIC-kolommen om het programma te analyseren. Een lineaire dalende zoutgradiënt en een scoutingmethode voor zes kolommen starten handmatig de stroom van de startbuffer bij één milliliter per minuut.Druk op start op de splitter-controller om direct na het starten van de programmamethode de 90% naar 10% EIT-stroomsplitsing te beginnen. Druk op start op het bedieningspaneel op het scherm van de offline 96-wells plaat fractiecollector. Observeer het real-time display om de verwachte run-parameters te bevestigen. Vergelijk de GFP-specifieke 397 nanometer absorptiecurve met de algemene eiwit- 280 nanometer absorptiecurve om de relatieve scheiding en zuivering te schatten met behulp van de verschillende gescoute HI-media. Aliquots van 5 tot 50 µL uit de 96-wells plaatfracties kunnen worden overgebracht naar een nieuwe plaat en geanalyseerd worden op specifiek eiwitgehalte via ELISA of Western blot en op totaal eiwitgehalte met behulp van SDS-PAGE of een Experian microfluïdisch elektroforesesysteem. Representatieve HIC-zoutgradiëntgeleidbaarheid en kolomdruk van de scouting-runs worden hier getoond.De verandering in zoutconcentratie, gemeten als het percentage buffer dat uit de lijnen met hoge zoutconcentratie wordt getrokken, is kenmerkend voor de HI-methodologie. Naarmate de zoutconcentratie afneemt, elueren de aan de kolom gebonden eiwitten; de conductiviteit, die overeenkomt met de waargenomen zoutconcentratie, wordt in lijn direct na de quad tech- en UV-detectoren gemeten. Het verschil tussen de zoutgradiënt en de conductiviteitscurves geeft de tijd aan die de buffer nodig heeft om van de bufferinlaat door het systeem naar de conductiviteitsmonitor te reizen.Gedurende de monsteranalyse blijven de systeemdruk en de pH relatief constant. Deze figuur toont chromatogrammen van opeenvolgende HI-kolomscoutingruns met inline detectie van totaal eiwit. NGFP wordt gerealiseerd door respectievelijk de lichtabsorptie bij 280 nanometer en 397 nanometer te meten.Het is mogelijk om de relatieve GFP-overvloed en scheiding voor elke scouting-run te benaderen. Door de twee lijnen in deze figuur te vergelijken, werden de kweekbuisjes voor fracties 10, 12, 14, 16 en 18 van de venkel FF scouting-run gevisualiseerd onder omgevings- of fluorescentielicht en ultraviolette lichtbuizen, waarbij zowel van voren als van boven werd gekeken om het karakteristieke GFP-emissiespectrum waar te nemen; GFP wordt duidelijk gedetecteerd in fractie 14. In beide UV-afbeeldingen is het diffuse blauw in het linker UV-paneel licht dat wordt uitgezonden door de UV-lamp.Deze data na de run komen goed overeen met de inline-detectie van GFP door de absorbentie van het eluaat bij 397 nanometer te meten, wat fractie 14 eveneens identificeert als de fractie die de hoofdpiek van het gezuiverde GFP bevat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals western blotting, ELISA's, atoomkrachtmicroscopie en biochemische reconstitutie-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de zuiverheid en functionele activiteit van het eiwit dat wordt gezuiverd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de noodzaak van handmatige bediening van het dubbele stroomsysteem op verschillende punten in de methode. Voorbeelden hiervan zijn het bijvullen van buffers en het laden van monsters, het controleren op luchtbellen en het naar behoefte in- en uitschakelen van detectielampen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u een vloeistofchromatografiesysteem gebruikt voor het geautomatiseerd scouten naar optimale HI-kolommen en media.Op basis van de inline- en posteranalyse kan een onderzoeker een geschikte kolom selecteren voor een daaropvolgende opschaling van de zuivering, wat eventueel kan worden gecombineerd met andere chromatografische methoden om de zuiverheid en opbrengst van het doeleiwit te verhogen.

automated-hydrophobic-interaction-chromatography-column-selection-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate an anion-exchange chromatography technique to purify human calcium-binding protein S100A12 based on the net surface charge of the protein from an Escherichia coli culture.

Anion-Exchange Chromatography-Based Protein Purification: A Separation Technique to Isolate a Protein of Interest From Dialyzed Bacterial Lysate Based on Net Charge

In this video, we demonstrate the purification of calcium-binding protein from a dialyzed cell lysate through calcium-dependent hydrophobic interaction chromatography. The calcium-binding proteins expose a hydrophobic region upon binding with calcium, facilitating interaction with a hydrophobic group on resin. Later these proteins are eluted using calcium chelator EDTA that reverses the interaction.

Calcium-Dependent Hydrophobic Interaction Chromatography: A Technique to Purify Calcium-Binding Proteins Based on Hydrophobic Interactions

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

This video demonstrates the principle of separation of hydrophilic polar compounds using hydrophilic interaction liquid chromatography. This technique helps in the purification of various polar analytes, including N-glycans.

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Separate Hydrophilic Polar Analytes Using Hydrophilic Beads

This video demonstrates the hydrophobic interaction liquid chromatography-based characterization of antibody-drug conjugates. Using a butyl ligand-based chromatography column, the antibody-drug conjugates are characterized via hydrophobic interactions with the ligand.

Butyl-Dependant Hydrophobic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Characterize Antibody-Drug Conjugates Based on Hydrophobic Interactions

This video showcases the purification of histidine-tagged self-assembled protein nanoparticles or SAPNs using affinity liquid chromatography. The resulting purified SAPN fractions are suitable for vaccine development, holding promise for potential immunotherapeutic applications.

Purification of Self-Assembling Protein Nanoparticles using Affinity Chromatography

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Een multi-kolom plaatadapter maakt het mogelijk om chromatografiekolommen te koppelen aan multi-well verzamelplaten voor parallelle affiniteit of ionenuitwisselingszuivering, wat een economische eiwitzuiveringsmethode met hoge doorvoer biedt. Het kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm het leveren van milligram hoeveelheden eiwit via betaalbare instrumentatie.

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Mama is een uniek Magnetosome geassocieerd eiwit dat werd aangetoond dat het betrokken is bij magnetosome activering. Hier presenteren we de zuivering protocol van Mama deletiemutant (MamAΔ41)...

Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

Leer een geautomatiseerde methode voor het selecteren van optimale hydrofobe interactiechromatografie-kolommen voor eiwitzuivering met een medium-druk vloeistofchromatografiesysteem. Deze aanpak vermindert variabiliteit en garandeert reproduceerbare resultaten.

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

Meer video's verkennen