Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

Het algemene doel van deze procedure is het selecteren van een optimale HI-vloeistofchromatografiekolom met behulp van een geautomatiseerde scoutingmethode voor de zuivering van een recombinant eiwit met een BioRad DUO flow medium druk vloeistofchromatographiesysteem. Dit wordt bereikt door eerst de benodigde buffers en bacteriële lysaten die het recombinante eiwit van belang bevatten voor te bereiden. Vervolgens wordt het duo flow chromatographiesysteem fysiek opgesteld, aangesloten en voorbereid voor het scoutingprotocol.

Vervolgens worden de monsters geladen en wordt de geprogrammeerde HI-kolomscreeningsmethode uitgevoerd om de fractie-monsters te verzamelen. Ten slotte wordt de EIT geanalyseerd en worden de optimale HI-kolom en het medium geïdentificeerd op basis van de waargenomen scheidingskenmerken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een preferent HI-kolommedium aanwijzen voor het opgeschaalde zuiveringsproces van het eiwit van interesse van de onderzoeker via medium-druk vloeistofchromatografie, gebruikmakend van de geautomatiseerde DUO-flow HI-kolomscreeningsmogelijkheden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals opeenvolgende runs van handmatige kolomchromatografie, is dat automatisering van het proces de variabiliteit vermindert en zeer reproduceerbare resultaten garandeert. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben met de fysieke complexiteit van moderne vloeistofchromatografiesystemen. Dit kan echter gemakkelijk worden onder de knie gekregen.

Na voldoende oefening zullen Orange Stone en Shelly Anderson, twee studenten uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren. Begin met het bereiden van 500 milliliter van de volgende buffers: 200 millimolair natriumfosfaat voor buffer A1, 200 millimolair natriumwaterstoffosfaat voor buffer A2 en 4,8 molair ammoniumsulfaat voor buffer B2; gedeïoniseerd water dient als buffer B1. Ontgas de buffers om optimale chromatografische bedrijfsomstandigheden te waarborgen. De systeemmaximizer zal buffers A1 en A2 mengen om een fosfaatelutiebuffer met een laag zoutgehalte te genereren, en buffers B1 en B2 mengen om ammoniumsulfaat met een hoog zoutgehalte te genereren.

Startbuffer. Bereid 20 milliliter van het monster dat geladen moet worden door 10 milliliter cellysaat dat het te zuiveren eiwit bevat te mengen met 10 milliliter buffer B twee. De uiteindelijke ammoniumsulfaatconcentratie van de cellysaatmonsteroplossing moet ongeveer 2,4 molar zijn, waardoor deze nagenoeg gelijk is aan de startbuffer.

Filtreer het mengsel van lysaatbuffer door een spuitfilter van 0,45 micrometer met lage eiwitbinding om particulate matter uit de oplossing te verwijderen. Bewaar het monster op ijs tot het klaar is om in het systeem te worden geladen. De fysieke opstelling en de leidingen van het chromatografiesysteem vormen een van de meest complexe aspecten van deze procedure.

Stel het duo-flow chromatografiesysteem in volgens het hier getoonde diagram. Zorg dat er voldoende volumes buffer beschikbaar zijn voor het gehele protocol en dat de slangjes ondergedompeld blijven. Sluit de monsterlaadklep en de dynamische monsterloop aan zoals hier geïllustreerd, en verbind de monsterloop met de monsterklepinlaat op positie drie.

Bereid acht identiek grote paren peak-tubing met een buitendiameter van 1/16 inch voor. Verbind vervolgens de paren met de posities één tot en met acht van de twee kolomselectiekleppen. Nadat de lampen van de UV-detector zijn ingeschakeld en is bevestigd dat alle detectoren zijn gekalibreerd, bevestigt u de stream-splitterklep en de splittercontroller van de fractiecollector zoals hier geïllustreerd.

De splitklep en de splitcontroller van de fractieopvangunit op positie twee worden offline van het chromatografie-station bediend. Stel de splitpercentage in op 10. Vervang de standaard opvangkop van de fractieopvangunit op positie twee door een microplate-opvangkop.

Spoel de monsterlus uit en spoel het chromatografiesysteem door. Start vervolgens een handmatige stroom van evolutiebuffer van één milliliter per minuut door het systeem. Sluit high trap HI-kolommen van één milliliter aan op posities twee tot en met acht van de kolomselectiekleppen.

Verwijder de koppeling die de kolomselectieventielen van positie twee met elkaar verbindt. Bevestig de fittingen van de upstream kolom aan de duo flow. Laat de elutiebuffer door de fittingen stromen totdat alle lucht is verdreven en er een grote druppel buffer aanwezig is.

Verwijder vervolgens de stopper die aan de kolomingang is verbonden en breng een grote druppel buffer met een laag zoutgehalte aan op de bovenkant van de kolom. Bevestig de kolom vervolgens aan de upstream-koppelingen. Sluit de uitlaat aan op de downstream-kolomkoppelingen en de slang van de selectieklep.

Stel de tegendruklimiet in op 40 PS.I. Was de kolom met vijf kolomvolumes elutiebuffer bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Was de kolom met 10 kolomvolumes startbuffer bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut.

Zodra de pH- UV-registraties en de tegendruk zijn gestabiliseerd, worden de kolomselectieventielen handmatig naar positie één geschakeld en wordt de bufferstroom gestopt. Om een monster te laden, wordt de monsterinlaatleiding ondergedompeld in het monster van 20 milliliter. Schakel vervolgens het monsterlus-laadspoelventiel naar positie één en het monsterlaadventiel naar spoelen.

Activeer de monsterlus-laadpomp, waarbij het monster met een stroomsnelheid van 1 ml/min in de pompslang wordt getrokken tot het monster net het monsterlaadventiel heeft bereikt. Zet het monsterlaadventiel van purgeren naar laden. Start de monsterlus-laadpomp opnieuw bij een stroomsnelheid van 1 ml/min tot er 10 ml monster in de dynamische monsterlus is getrokken via het configuratievenster van de biologic-software.

Selecteer de systeemapparatuur die in deze tabel is gemarkeerd met een asterisk. Selecteer vervolgens zes HIC-kolommen om het programma te analyseren. Een lineaire dalende zoutgradiënt en een scoutingmethode voor zes kolommen starten handmatig de stroom van de startbuffer bij één milliliter per minuut.

Druk op start op de splitter-controller om onmiddellijk te beginnen met de 90% tot 10% EIT-stroomsplitting; druk direct na het starten van de programmamethode op start op het onscreen-bedieningspaneel van de offline fractiecollector voor 96-wells platen. Observeer het real-time display om de verwachte run-parameters te bevestigen. Vergelijk de GFP-specifieke 397 nanometer absorbentiecurve met de algemene proteïne 280 nanometer absorbentiecurve om de relatieve scheiding en zuivering te schatten bij gebruik van de verschillende HI-media die worden gescout; aliquoten van 5 tot 50 µL uit de 96-wells plaatfracties kunnen worden overgebracht naar een nieuwe plaat en geanalyseerd worden op specifiek proteïnegehalte via ELISA of Western blot, en op totaal proteïnegehalte met SDS-PAGE of een Experian microfluidisch elektroforesesysteem. Representatieve hick-zoutgradiëntgeleidbaarheid en kolomdruk van de scouting-runs worden hier getoond.

De verandering in zoutconcentratie, gemeten als het percentage buffer dat uit de lijnen met hoogzoutbuffer wordt getrokken, is kenmerkend voor de HI-methodologie. Naarmate de zoutconcentratie afneemt, elueren de aan de kolom gebonden eiwitten; de geleidbaarheid, die overeenkomt met de waargenomen zoutconcentratie, wordt in de lijn direct na de quad tech- en UV-detectoren gemeten. Het verschil tussen de zoutgradiënt en de geleidbaarheidscurves geeft de tijd aan die de buffer nodig heeft om van de bufferinlaat door het systeem naar de geleidbaarheidsmonitor te reizen.

Gedurende de monsteranalyse blijven de systeemdruk en pH relatief constant. Deze figuur toont chromatogrammen van opeenvolgende HI-kolom verkenningsruns en de inline detectie van het totaal eiwit. NGFP wordt gerealiseerd door de absorptie van licht bij respectievelijk 280 nanometers en 397 nanometers te meten.

Het is mogelijk om de relatieve GFP-overvloed en scheiding voor elke verkennende run te benaderen. Door de twee lijnen in deze figuur te vergelijken, werden kweekbuisjes voor fracties 10, 12, 14, 16 en 18 van de fennel FF verkennende run gevisualiseerd onder omgevings- of fluorescent kamerlicht en ultraviolette lichtbuizen; deze werden zowel van voren als van bovenaf bekeken om het karakteristieke GFP-emissiespectrum waar te nemen, waarbij GFP duidelijk wordt gedetecteerd in fractie 14. In beide UV-afbeeldingen is het diffuse blauw in het linker UV-paneel licht dat wordt uitgezonden door de UV-lamp.

Deze data na de run komen goed overeen met de inline detectie van GFP door de absorptie van het eluaat bij 397 nanometer te meten, waarbij fractie 14 eveneens wordt geïdentificeerd als de fractie die de hoofdpiek van het geëlueerde GFP bevat. Na uitvoering van deze procedure kunnen andere methoden, zoals western blotting, ELISA's, atoomkrachtmicroscopie en biochemische reconstitutie-assays, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden over de zuiverheid en functionele activiteit van het gezuiverde eiwit.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de noodzaak voor handmatige besturing van het dual-flow systeem op verschillende punten in de methode. Voorbeelden hiervan zijn het bijvullen van buffers en het laden van monsters, het controleren op luchtbellen en het naar behoefte in- en uitschakelen van detectielampen. Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in hoe een vloeistofchromatografiesysteem kan worden gebruikt voor het geautomatiseerd scouten naar optimale HI-kolommen en -media.

Op basis van de inline- en posteranalyse kan een onderzoeker een geschikte kolom selecteren voor een daaropvolgende opschaling van de zuivering, wat eventueel gecombineerd kan worden met andere chromatografische methoden om de zuiverheid en opbrengst van het doeleiwit te verhogen.