Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy
18 juli 2011
Een tapping mode atomic force microscoop (AFM) methode voor de visualisatie van plasmide DNA, cytoplasmatische eiwitten en DNA-eiwitcomplexen is beschreven. De methode bestaat uit alternatieve benaderingen voor het bereiden van monsters voor AFM beeldvorming volgende biochemische manipulatie. DNA met specifieke eiwit interactie regio's zijn waargenomen in de buurt-fysiologische buffer omstandigheden.
Het algemene doel van deze procedure is om biomoleculen zoals DNA en eiwitten in waterige buffers in realtime te beeldvormen met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst biomoleculen voor te bereiden die moeten worden afgebeeld. Vervolgens wordt de atoomkrachtmicroscoop ingesteld en wordt de FM cantilever sonde gepositioneerd.
De monsteroppervlakte en biomoleculen van belang worden vervolgens beeldvormd en geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de algemene grootte, hoeveelheid en organisatie van DNA en eiwitten en heterogene biomoleculaire complexen in gebufferde omstandigheden laten zien door middel van atoomkrachtmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire chaperonen, zoals wat de STO-geometrie is van chaperonen en cos-chaperonen complex met een klant.
De visuele demonstratie van deze methode voor eiwitten is nuttig omdat de stappen voor de voorbereiding van de A FM en Kent lever sonde moeilijk te leren zijn uit gedrukte instructies, grotendeels vanwege de complexiteit van hun fysieke manipulatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Morgan Shannon en John Gertz, twee studenten uit mijn laboratorium. Om te beginnen, isoleer de eiwit- of DNA-moleculen die moeten worden afgebeeld en suspendeer ze in een waterige buffer. Nadat de zuiverheid van het monster is bevestigd, incubeer het in een FM absorptiebuffer op ijs om de hechting van het monster aan mica te bevorderen.
Gebruik voor eiwitmonsters een 10 millimolair heaps buffer. En voor DNA een magnesiumbevattende buffer bestaande uit 10 millimolair tris, pH 7,5 10 millimolair natriumchloride, twee millimolair magnesiumchloride is geschikt om de A FM sonde te monteren. Plaats de houder van de sonde in de vloeistofcel op de overeenkomstige cantilever-installatiedocking station.
Lokaliseer de lange dikke cantilever van de scherpe nitride lever sonde die wordt gebruikt voor beeldvorming. Breng het voorzichtig over naar de houder van de sonde in de vloeistofcel, zorg ervoor dat de punt rechtop blijft. Bekijk vervolgens de cantilever onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat deze intact is en goed geplaatst zit in de houder van de sonde in de vloeistofcel.
Verwijder vervolgens voorzichtig de FM kop van de instrument-splijtverbinding door de kopklemschroef vast te draaien. Draai de FM kop om en duw de houder van de sonde in de vloeistofcel stevig op de vier pinnen aan de basis van de FM kop. Plaats tenslotte de FM kop voorzichtig terug in de staartassemblage van het instrument.
Om de FM verder voor te bereiden voor het beeldvormen van monsters, verplaats de knoppen van de ingebouwde lichtmicroscoop om de cantileverpunt te lokaliseren, pas de op- en neerpijlen van de opticacontroller in de software aan om de cantileverpunt scherp te stellen. Gebruik de laseraanpassingsknoppen om de laser uit te lijnen met de cantileverpunt. Dit is een van de meest technisch uitdagende stappen in het protocol. Positionering wordt handmatig uitgevoerd en vereist nauwkeurige knopaanpassing.
Zorgvuldige monitoring van de laser in de reflectievlek en de verlichtingsvlek verhoogt de kans op succesvolle uitlijning. Pas vervolgens de fotodetectorknoppen op de FM kop aan om de fotodetector te centreren. Plaats een vers gekloven vel MICA bevestigd aan een metalen FM specimen-schijf op de gemagnetiseerde monsterhouder bovenop de A FM houderplaat.
Draai de FM houderplaat zodat de specimen-schijf is gepositioneerd voor de initiële beeldvorming. Gebruik de focusoppervlaktecontrole van de instrumentsoftware om de FM kop naar het oppervlak van de MICA specimen-schijf te bewegen. Totdat duidelijke kenmerken op het MICA-oppervlak of de tipreflectie scherp zijn, selecteert u het afstemmingspictogram uit de instrumentsoftware en stemt u de cantilever af.
De resonantiefrequentie van aanbevolen MSNL of SNL sondes is 20 tot 60 kilohertz. Selecteer een 5% piekoffset om het MICA-monster af te beelden. Schakel eerst de sonde in op het MICA-oppervlak, stel de initiële scangrootte in op 10 micrometer en de scansnelheid op een hertz.
Vang volledige scanbeelden van het 10 micrometerveld in. Verlaag vervolgens de scanschaal tot vijf, één en 0,5 micrometer en vang volledige afbeeldingen van elk veld in. Schakel de sonde uit door eenmaal op het uitschakelpictogram in de instrumentsoftware te klikken.
Om biomoleculen van belang af te beelden, meng vijf microliter van het voorbereide monster met 45 microliter verse absorptiebuffer. Voeg voorzichtig 50 microliter van de 0,5 microgram per milliliter biomolecuulbevattende oplossing direct toe op het oppervlak van de MICUs. Wacht vijf minuten om de biomoleculen in het monster te laten hechten aan het Micah-oppervlak.
Pipetteer vervolgens nog eens 50 tot 100 microliter absorptiebuffer in de houder van de sonde in de vloeistofcel. Zorg ervoor dat u de sonde, FM kop of MICA niet aanraakt met de punt van de pipetter, pas de fotodetector aan en lijn de laser opnieuw uit naar de cantilever zoals nodig is. Gebruik vervolgens de instrumentsoftware om de sonde opnieuw in te schakelen.
Vergroot de scanschaal om gebieden van belang te identificeren. Zodra de beeldvorming is voltooid, selecteert u het terugtrekpictogram in de instrumentsoftware meerdere keren om de sonde uit te schakelen. Gebruik ten slotte gedistilleerd water om de houder van de sonde in de vloeistofcel en de specimen-schijf grondig te spoelen.
Probeer het vervolgens met perslucht. Een voorbeeld van een A FM-afbeelding wordt hier getoond. Het mica-substraat biedt een moleculair vlak oppervlak waarop DNA en eiwitten kunnen absorberen.
Beeldvorming van MICA vóór biomolecuulmonsters biedt een negatieve controle en een beoordeling van beeldvormingsruis. Het biedt ook een mate van zekerheid dat de cantilever goed is afgesteld en dat de volgende monsterbeeldvorming succesvol zal zijn. Dubbelstrengs plasma-DNA, vermoedelijk supergewonden, wordt gemakkelijk herkend aan zijn asymmetrische verschijning en uniforme afzetting op het voorheen onopvallende Micah-substraat.
Eiwitcomplexen van discrete deeltjesgroottes zijn ook uniek te onderscheiden van het Micah-substraat. Verschillen in deeltjesgrootte du
Overzicht
Dit artikel beschrijft een tapping mode atomic force microscopy (AFM) methode voor het visualiseren van biomoleculen zoals plasmide DNA en eiwitten in bijna fysiologische bufferomstandigheden. De methode omvat monstervoorbereidingstechnieken die de beeldkwaliteit en nauwkeurigheid verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Biochemie
Achtergrond
- Atomic force microscopy (AFM) is een krachtig hulpmiddel voor het beeldvormen van biomoleculen.
- Het begrijpen van de interacties tussen DNA en eiwitten is cruciaal in de moleculaire biologie.
- Monstervoorbereiding is essentieel voor succesvolle AFM-beeldvorming.
- Real-time beeldvorming in gebufferde omstandigheden kan inzicht geven in biomoleculaire structuren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldvormen van DNA en eiwitten in waterige buffers met behulp van AFM.
- Om DNA-eiwitcomplexen en hun organisatie te visualiseren.
- Om het begrip van moleculaire chaperon-interacties te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van biomoleculen in geschikte buffers.
- Installatie en kalibratie van het AFM-instrument.
- Beeldvorming van monsters op een mica-substraat.
- Analyse van biomoleculaire grootte, hoeveelheid en organisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van dubbelstrengs plasmide DNA en eiwitcomplexen.
- Identificatie van monsterheterogeniteit door verschillen in deeltjesgrootte.
- Visualisatie van DNA- en eiwitorganisatie op het mica-oppervlak.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode in real-time beeldvorming.
Conclusies
- De AFM-methode biedt waardevolle inzichten in biomoleculaire interacties.
- Monstervoorbereiding is cruciaal voor hoogwaardige beeldvormingsresultaten.
- Deze techniek kan onderzoek in moleculaire chaperon-studies bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM) enables direct visualization of recombinant DNA, proteins, and their complexes in near-physiologic buffer conditions, supporting early-stage mechanistic de-risking and target validation. This capability provides biopharma R&D teams with high-resolution, label-free structural insights critical for understanding biomolecular interactions and complex assembly. Integrating AFM imaging into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage decisions at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of DNA-protein and protein-protein complexes clarifies molecular assembly and interaction specificity.
- AFM imaging supports functional target validation by revealing complex stoichiometry and heterogeneity.
- Structural mapping of biomolecular complexes reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Label-free imaging in buffered conditions preserves native conformations for accurate hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- AFM provides quantitative topographical data to assess sample homogeneity and complex formation.
- Imaging outputs enable standardization of biomolecule preparations for downstream assays.
- Real-time visualization supports reproducibility and assay readiness for screening campaigns.
- Platform adaptability allows reuse across diverse protein and nucleic acid targets.
Translational & Preclinical Research
- AFM imaging informs preclinical model selection by characterizing disease-relevant biomolecular assemblies.
- Structural insights support translational biomarker alignment when complex formation is linked to functional outcomes.
- Quantitative measurements guide risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Mechanistic de-risking is enabled by direct observation of molecular interactions under physiologic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM imaging fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable analytical capability for structural interrogation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA and protein-protein interactions at the single-molecule level.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible imaging outputs to benchmark assay performance and sample quality.
- Analytics: Delivers topographical and dimensional data for comparative analysis of biomolecular complexes.
- Translational Research: Supports continuity by linking structural features to functional and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a wide range of biomolecules, supporting multiple programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying complex assembly.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, cantilever tuning, and sample preparation.
- Demands access to high-resolution AFM instrumentation and analytical software.
- Cross-team standardization is essential for reproducible imaging and data interpretation.
- Buffer composition and substrate selection must be optimized for each biomolecule type.
- Tip convolution and scan rate limitations may affect absolute dimensional measurements.
