B Cell Activation on an Antigen-Coated Coverslip
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:41 min • July 8th, 2025
B cell activation involves the recognition of antigens by B cell receptors, BCRs, on their surface to elicit an immune response.
To study B cell activation in vitro, begin with a coverslip containing antigens and anti-CD45R antibodies, immobilized over a polymeric material. The negatively-charged antigens and antibodies interact with positively-charged polymers on the coverslip through electrostatic interactions.
Overlay the coated coverslips with a medium containing B cells and incubate. The CD45R — the transmembrane protein of B cells — interacts with the immobilized antibodies, facilitating cell adhesion.
The BCRs on the adhered B cell interact with an antigen, forming an immune synapse — the coordination region for cell signaling and antigen internalization. This promotes cytoskeleton remodeling and initiates cell spreading, which increases the cell surface in contact with the antigens.
Further remodeling causes the movement of BCR-coupled antigens toward the center of the immune synapse. This cellular rearrangement causes the repositioning of the centrosome near the synaptic membrane that guides intracellular organelles, including lysosomes, toward the synapse.
The fusion of lysosomes with the membrane leads to the internalization of the antigen-BCR complexes. The internalized antigens are processed into peptide fragments, loaded onto class-II major histocompatibility complex or MHC molecules, and finally presented on activated B cells.
Prepare the antigen solution by adding anti-BCR and B220 in PBS to a final concentration of 10 micrograms per mL and 7.5 micrograms per mL respectively. Next, set the coverslip over a lid of 24-well plate covered with paraffin film, and add 40 microliters of antigen solution. Seal the plate, and then incubate at four degrees overnight.
To start the activation in coverslip, first, wash them with PBS, and let them dry for a few minutes. Next, add 150,000 B cells, and incubate at 37 degrees for the different time points. In both cases, when activating either with beads or antigen-coated slides, we recommend starting with the longest time point, and then proceeding to the shorter ones.
Overzicht
Dit artikel demonstreert een in vitro protocol voor het bestuderen van organeldynamiek in B-cellen tijdens de vorming van de immuunsynaps. De methode richt zich op de opeenvolging van gebeurtenissen na antigeenherkenning door B-celreceptoren (BCR's), inclusief cytoskeletale remodellering, vorming van de immuunsynaps, lysosoomverplaatsing, antigeninternalisatie en antigenpresentatie op MHC-klasse II-moleculen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Celanalyse op basis van microscopie
Achtergrond
- B-celactivatie wordt geïnitieerd door antigeenherkenning via BCR's.
- De vorming van de immuunsynaps is cruciaal voor een effectieve antigeenverwerking en -presentatie.
- Cytoskeletale remodellering en herpositionering van organellen zijn essentieel voor de internalisatie van antigenen.
- Het begrijpen van deze processen biedt inzicht in adaptieve immuunresponsen.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van organellen, in het bijzonder lysosomen, te visualiseren en te analyseren tijdens de vorming van de immuunsynaps van B-cellen.
- Om een reproduceerbaar in vitro systeem op te zetten voor het bestuderen van activatiemechanismen van B-cellen.
- Om de stappen te beschrijven die leiden van antigeenherkenning naar antigeenpresentatie in B-cellen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van met antigeen gecoate dekglasjes met behulp van anti-BCR- en B220-antilichamen in PBS.
- Immobilisatie van antigenen en antilichamen op dekglasjes via elektrostatische interacties met een polymeer substraat.
- Incubatie van B-cellen op gecoate dekglasjes om de vorming van de immuunsynaps te induceren.
- Observatie van cytoskelet-remodellering, organelbeweging en antigeninternalisatie op verschillende tijdstippen.
Belangrijkste resultaten
- B-cellen hechten zich aan met antigenen gecoate dekglasjes via CD45R-antilichaaminteracties.
- BCR-binding met antigenen triggert de vorming van de immuunsynaps en cytoskeletale veranderingen.
- Herpositionering van het centrosoom en lysosomen richting de synaps faciliteert de internalisering van antigenen.
- Geïnternaliseerde antigenen worden verwerkt en gepresenteerd op MHC-klasse II-moleculen op geactiveerde B-cellen.
Conclusies
- Het beschreven protocol maakt gedetailleerd onderzoek naar organeldynamiek tijdens B-celactivatie mogelijk.
- De vorming van de immuunsynaps omvat gecoördineerde reorganisaties van het cytoskelet en de organellen.
- Dit systeem biedt een waardevol platform voor het ontleden van moleculaire mechanismen van antigeenverwerking en -presentatie in B-cellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
In vitro B-celactivatie op met antigeen gecoate dekglasplaatjes maakt een precieze analyse van de vorming van de immuunsynaps en organel-dynamiek mogelijk, wat vroege immunologische ontdekkingen ondersteunt. Dit systeem biedt mechanistisch inzicht in antigeenverwerking en -presentatie, wat bijdraagt aan targetvalidatie en risicoreductie bij de ontwikkeling van immunotherapieën. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen voor downstream screening en translationeel onderzoek naar adaptieve immuniteit.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar B-celreceptor-signalering en de vorming van de immuunsynaps mogelijk voor functionele targetvalidatie.
- Verduidelijkt mechanismen van cytoskelet- en organelremodellering, waardoor biologische ambiguïteit in de vroege ontdekkingsfase wordt verminderd.
- Ondersteunt het voorspellend vertrouwen in antigeenverwerkingspaden die relevant zijn voor immunotherapietargets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar in vitro systeem vast voor gestandaardiseerde B-celactivatie-assays.
- Faciliteert de kwantitatieve meting van antigeninternalisatie en -presentatie voor de ontwikkeling van assays.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows voor het screenen van verbindingen of antilichamen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro-bevindingen met ziekterelevante immuunmechanismen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistisch inzicht in antigeenpresentatie te bieden.
- Maakt preklinische modellering van adaptieve immuunresponsen mogelijk voor immunomodulerende strategieën.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot preklinisch immunologisch onderzoek, en ondersteunt zowel de validatie van targets als de gereedheid van assays.
- Ontdekkingsbiologie: Biedt een platform voor hypothesetoetsing van B-celactivatie en de dynamiek van de immuunsynaps.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten voor de kwantitatieve beoordeling van antigeenverwerking.
- Analytica: Maakt meting van organelbeweging, antigeninternalisatie en MHC-presentatie mogelijk voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische ontdekkingen en preklinische studies naar immuunfuncties.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Biedt een herbruikbaar assay-systeem voor diverse programma's in de immunologie en celbiologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische onzekerheid in studies naar immuunpaden.
- Operationele waarde: Standaardiseert B-celactivatieprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie in immunologieportefeuilles.
- Impact op portefeuille: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immunotherapeutische targets en modaliteiten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunologie, celcultuur en microscopie-gebaseerde analyse.
- Toegang tot antigen-coatingsreagentia, hulpmiddelen voor de bereiding van dekglasjes en beeldvormingsinfrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de reproduceerbaarheid van de assay en de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan diverse antigen- en antilichaamsystemen voor een bredere toepassing.
- Beperkt tot in vitro modellering; in vivo validatie kan vereist zijn voor translationele claims.
Veelgestelde vragen over biopharma
In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
CTC Immunofluorescence Assay : A Technique to Characterize Circulating Tumor Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Organelle Dynamics in B Lymphocytes following Activation with Antigen-Coated Beads
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vitro Technique to Study T Cell Interaction with Supported Planar Lipid Bilayers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Monitoring B Cell Activation with Antigenic Liposomes using a Calcium-Flux Assay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Evaluation of Controlled T Cell Activation with a Photoactivatable Peptide MHC
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026