Intrathoracic Viral Nano-Injection to Study Host-Virus Interactions in Adult Flies
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:52 min • July 8th, 2025
Take anesthetized wild-type and Dicer-2 mutant male Drosophila on an injection dish under a stereomicroscope. Ensure the flies are free of any symbiotic bacteria that suppress RNA virus replication.
Inoculate the flies intra-thoracically with a nano-injector containing a positive-sense, single-stranded RNA virus suspension.
The virus enters the host cell via receptor-mediated endocytosis and replicates producing double-stranded intermediate RNA. The host pattern recognition receptor Dicer-2 processes the viral double-stranded RNA into small interfering RNAs, siRNAs.
The siRNA binds to the RNA-induced silencing complex, RISC, where its complementary strand is removed. The RISC-loaded siRNAs bind to other viral RNAs via complementary base pairing, causing viral RNA degradation and gene silencing.
Dicer-2 and viral RNA interaction activates downstream antiviral signaling cascades, producing antiviral proteins. These antiviral proteins interact with neighboring host cells' Janus kinase, or JAK, protein-bound cytokine receptors, initiating receptor dimerization and JAK phosphorylation.
Activated JAKs phosphorylate and activate STAT proteins, a signal transducer and transcription activator. Activated STATs translocate to the nucleus and bind to specific DNA sequences, initiating the transcription of antiviral response genes.
Grow the flies for a desired period.
Downstream analysis indicates decreased survival rate and increased viral load in Dicer-2 mutant flies.
For viral infection, first, use a stereomicroscope and thin forceps to break the tip of a glass capillary needle to the appropriate diameter for nano-injection. To assemble the injector, place the sealing O-ring and a white spacer onto the metal plunger of the injector with the large dimple facing outwards.
Use a syringe equipped with a 30-gauge needle to fill the glass needle with mineral oil and place the needle through the collar. Place the larger O-ring around the base of the collar, about 1 millimeter from the blunt end of the needle, and mount the needle onto the plunger of the injector.
Secure the needle onto the plunger, and press the empty button to extend the plunger of the microinjector until an audible signal is heard. Now press Fill to retract the plunger 5 millimeters, and dip the needle into a 100 plaque-forming unit viral suspension. Gently shake one or at least three vials of 20 Wolbachia-free male Drosophila onto the injection dish.
Male-endowed flies are preferred as the hormonal variation during mating and reproduction may influence the readout with females.
Then, inject the thorax of each fly with 50.6 nanoliters of virus solution at the slightly lighter colored region between the mesopleura and the tetrapleura and measure the DCV load by the cytopathic effect assay and quantitative RT-PCR from ground flies as just demonstrated. After the injection, carefully transfer the flies to a fresh vial, and place the vial in a horizontal position to prevent the flies from sticking to the medium while recovering from the anesthesia.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de antivirale respons in Drosophila door de rol van het Dicer-2-eiwit bij de verwerking van viraal RNA te bestuderen. Het onderzoek belicht de mechanismen van RNA-interferentie en de daaropvolgende immuunrespons die wordt getriggerd door virale infecties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Virologie
- Genetica
Achtergrond
- Dicer-2 is een sleutelprotein dat betrokken is bij het RNA-interferentietraject.
- RNA-virussen kunnen de afweer van de gastheer omzeilen, waardoor robuuste antivirale responsen noodzakelijk zijn.
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van de aangeboren immuniteit.
- Het begrijpen van deze mechanismen kan bijdragen aan bredere antivirale strategieën.
Doel van de studie
- Om de rol van Dicer-2 in antivirale verdedigingsmechanismen te verduidelijken.
- Om de impact van Dicer-2-mutaties op de virale load en overlevingspercentages te beoordelen.
- Om de downstream-effecten van RNA-interferentie op de immuunresponsen van de gastheer te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van Drosophila met een RNA-virus met positieve polariteit.
- Gebruik van een nano-injector voor nauwkeurige virale toediening.
- Analyse van virale RNA-degradatie en mechanismen van gene silencing.
- Beoordeling van overlevingspercentages en virale ladingen in mutante en wild-type vliegen.
Belangrijkste resultaten
- Dicer-2 mutant vliegen vertoonden een verhoogde virale load in vergelijking met het wild-type.
- De overlevingspercentages waren significant lager bij de Dicer-2 mutanten.
- Activering van antivirale signaleringscascades werd waargenomen in wild-type vliegen.
- RNA-interferentiemechanismen werden bevestigd via downstream-analyse.
Conclusies
- Dicer-2 speelt een cruciale rol in de antivirale respons bij Drosophila.
- Mutaties in Dicer-2 verslechteren het vermogen van de gastheer om virale infecties te beheersen.
- Inzichten uit deze studie kunnen bijdragen aan het begrip van antivirale mechanismen in andere organismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Precieze intrathoracale virale nano-injectie in Drosophila maakt gecontroleerde analyse van gastheer-virusinteracties en de activering van aangeboren immuunpaden mogelijk. Deze benadering ondersteunt mechanische risicoanalyse en doelwitvalidatie voor antivirale responspaden, wat bijdraagt aan besluitvorming in vroege fasen van het portfolio binnen onderzoek naar infectieziekten. Kwantitatieve resultaten uit dit model verhogen het voorspellende vertrouwen voor daaropvolgende translationele studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Maakt directe toetsing van de functie van antivirale routes mogelijk via genetische en moleculaire perturbatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de impact van specifieke gastheerfactoren, zoals Dicer-2, te isoleren.
- Faciliteert functionele doelwitvalidatie voor RNA-interferentie en JAK/STAT-signaleringscomponenten.
- Biedt kwantitatieve resultaten voor hypothese-gestuurde triage van portfolio's.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar in vivo-systeem vast voor het evalueren van de gastheerrespons op een virale uitdaging.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten via RT-PCR en assays voor cytopathische effecten.
- Maakt de assay gereed voor het screenen van genetische of farmacologische modulatoren van antivirale pathways.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform voor vergelijkende studies tussen verschillende genotypes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde aangeboren immuunmechanismen die over verschillende soorten heen geconserveerd zijn.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van antivirale targets.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaat-paden mogelijk op basis van functioneel in vivo bewijs.
- Ondersteunt voorspellende risicoreductie voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinische validatie, waarbij genetische doelwitinterrogatie wordt verbonden met kwantitatieve fenotypische resultaten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing voor mechanismen van gastheer-virusinteracties en pathway-activatie.
- Screening: Biedt reproduceerbare, assay-klare infectiemodellen voor het evalueren van genetische effecten of de effecten van verbindingen.
- Analytica: Levert kwantitatieve gegevens over virale load en genexpressie voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen over aangeboren immuunpathways met preklinische biomarkerstrategieën.
- Hergebruik in de organisatie: Biedt een herbruikbaar in vivo platform voor iteratieve validatie van targets en pathways.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van antivirale targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert infectie- en analyseworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie in vroege stadia van antiviraal onderzoek.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van antivirale targets en pathways mogelijk voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica en de omgang met virussen.
- Toegang tot nano-injectie-instrumentatie en infrastructuur voor kwantitatieve PCR is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van infectie- en analyseprotocollen tussen teams.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende virusstammen of gastheergenotypes.
- Praktische beperkingen omvatten restricties van het modelorganisme en de schaalbaarheid van de doorvoer.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Mondelinge bacteriële infectie en Shedding bij Drosophila melanogaster
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol
Gerelateerde video's
0 Bekeken
RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Injectie van volwassen Drosophila-vliegen: een methode voor samengestelde of labelafgifte
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Infecting Flies with Bacterial Suspension Using a Nanoinjector
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026