Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

[Verteller] Dit protocol omvat aseptische technieken in plateermethoden die worden gebruikt om micro-organismen zoals bacteriën en fagen te isoleren, vermeerderen of tellen. Procedures omvatten het streepplateren van bacterieculturen om enkele kolonies te isoleren. Gietplateren om de concentratie van bacteriën te bepalen. En verspreidplateren om levensvatbare bacteriekolonies te tellen. Zachte agar-overlays worden gebruikt om fagen te isoleren en plaques te tellen, terwijl replica-plateren cellen van de ene plaat naar de andere overbrengt in een identiek ruimtelijk patroon. Uiteindelijk variëren de praktische toepassingen van deze technieken voor het kweken van micro-organismen van identificatie van bacteriën in omgevingen tot technologische vooruitgang in moleculaire genetica en bioassays met hoge doorvoer.

- Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze plateermethoden worstelen omdat de manipulaties zorgvuldige en gecoördineerde bewegingen vereisen om contact met niet-steriele oppervlakken te vermijden. Het leren van deze routineprocedures vereist training en oefening. De procedures zullen worden gedemonstreerd door mijn laboratoriumcoördinator, Dr. Kris Reddi.

- [Verteller] Begin met micro-organismen door de laboratoriumregels en veiligheidsmaatregelen te kennen, inclusief biohazardclassificatie, afvalontsmetting en -verwijdering. Bevestig dat alle instrumenten, oplossingen en media voor plateerprocedures steriel zijn. Maak ook een schone werkruimte. Reinig het met ontsmettingsmiddel. Zet een Bunsenbrander op met een buis die aan een gasleiding is bevestigd, leg de benodigde benodigdheden neer met goed geëtiketteerde materialen. Ga verder met het grondig wassen van de handen met antiseptische zeep en warm water. Wet eerst de handen met warm, stromend water, breng zeep aan en verdeel deze grondig. Wrijf krachtig over alle oppervlakken, waaronder duimen, achterkanten van vingers, achterkanten van de handen en onder de nagels. Spoel daarna grondig om resterende zeep te verwijderen en droog met papieren handdoeken die uit een houder worden gedeeld. Sluit tenslotte met een nieuwe papieren handdoek de kraan af. De Streak Plate Procedure is ontworpen om pure bacterieculturen of kolonies te isoleren uit gemengde populaties door eenvoudige mechanische scheiding. Haal een agarplaat uit een koude kast van vier graden Celsius en breng deze voor op kamertemperatuur. Selecteer een gereedschap uit de reeks instrumenten voor het strekken van de plaat. Zorg ervoor dat de plaat droog is zonder condensatie op het deksel. Label de onderkant van een agarplaat rond de rand. Wanneer u vakkundig bent, gebruikt u één plaat voor meerdere monsters. Ontsteek vervolgens een Bunsenbrander om de metalen lus te ontvlammen. Begin drie tot vier centimeter van de metalen lus met de draad in de punt van de blauwe kegel, het heetste deel van de vlamme van de Bunsenbrander. Wanneer het metaal gloeiend heet wordt, beweeg de draad zodat de vlamme de lus nadert. Om de lus af te koelen, raak het rand van het agarmedium aan waardoor een sissende klank ontstaat. Blijf het inoculum op de lus oppakken. Til de onderste helft van de plaat op. Beweeg de lus heen en weer van de rand naar het midden in het eerste kwadrant van de plaat. Zet de omgekeerde plaat terug op het deksel. Ontsteek de metalen lus opnieuw. Draai de petrischaal 90 graden. Raak de lus aan de rand van de laatste streep aan met het heen en weer bewegende patroon, steek het laatste deel van de strepen in het eerste kwadrant over, en beweeg dan naar het lege tweede kwadrant. Zodra het tweede kwadrant is gevuld, zet de plaat neer. Herhaal de strekkende procedure voor het derde en vierde kwadrant terwijl u contact met het eerste kwadrant vermijdt. Voor het strekken met een steriele, platte tandenstoker, houd de smalle kant voorzichtig tussen duim en ringvinger in een hoek van 10 tot 20 graden naar het medium, gebruik de brede kant om de kwadranten te strekken. Draai de plaat terug op het deksel tussen de kwadranten en gooi de tandenstoker op de juiste manier weg. Ga door met het incuberen van de gestreepte platen ondersteboven. De Pour Plate Procedure telt het totale aantal kolonievormende eenheden op het oppervlak en in de agar van een enkele plaat. Stel een timer in op 10 minuten en breng vervolgens 18 milliliter gesmolten agarmedium van een waterbad van 55 graden Celsius over naar een hitteblok van 48 graden Celsius en breng het in evenwicht voor 10 minuten. Label de onderkant van een steriele petrischaal. Voeg indien van toepassing de verdunningsfactor toe. Doseer nu één milliliter monster in het midden van de petrischaal. Sluit het deksel. Verwijder het dopje van de buis met gesmolten agar en haal de rand van de open buis door een vlam. Giet de agar voorzichtig in de petrischaal. Sluit het deksel en meng het monster met de agar door de plaat voorzichtig te zwaaien. Wacht 30 minuten om de agar te laten stollen. Zodra de agar is gestold, draai en plaats de plaat in een warme kamer. Verspreidplateren heeft tot doel micro-organismen in een klein monstervolume te scheiden en resulterende kolonies gelijkmatig over het agaroppervlak te verdelen. Breng een plaat in evenwicht op kamertemperatuur en label deze op de juiste manier. Plaats de plaat op de draaitafel. Pipetteer 0,1 milliliter monster in het midden van de agar en sluit het deksel. Gooi de punt in een afvalinische. Dompel de metalen staaf in een beker met 70% ethanol en bedek het hele onderste deel van de verspreider en de eerste centimeter van de stengel en laat het dan weglekken. Ontsteek overtollig ethanol door het door een vlam van een Bunsenbrander te laten gaan. Open vervolgens het deksel van de agarplaat en koel de verspreider af door het aan de agar langs de rand bij de rand te raken. Draai de draaitafel langzaam. Houd de verspreider voorzichtig op het oppervlak van de agar en verspreid het monster geleidelijk gelijkmatig over de hele plaat met een heen en weer bewegende beweging terwijl de draaitafel draait. Sluit het deksel en laat het monster minimaal vijf minuten grondig absorberen. Incubeer vervolgens de omgekeerde plaat. Label eerst de agarplaat op de juiste manier. Open het deksel van de agarplaat. Open vervolgens de container met voorgesteriliseerde