An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:06 min • July 8th, 2025
Begin with a plate containing a culture of primary macrophages.
Introduce bacterial lipopolysaccharide, LPS, that binds to toll-like receptors on macrophages, triggering upregulation of the protein NLR family pyrin domain-containing 3 or NLRP3.
Add an ionophore that mediates the efflux of potassium ions. Decreased cytosolic potassium activates NLRP3. Activated NLRP3 oligomerizes and induces the recruitment of an adaptor protein, which in turn recruits pro-caspase-1, forming an inflammasome.
Auto-proteolysis converts pro-caspase-1 to active caspase-1, which mediates inflammatory cell death or pyroptosis. DNA damage during pyroptosis leads to nuclear condensation.
Fix the cells and treat with a detergent to permeabilize them.
Add a primary antibody binding to the inflammasome-associated adaptor protein, and a fluorescently-labeled secondary antibody that binds to the primary antibody, labeling the inflammasome.
Introduce a fluorescent nucleic acid stain to label the nucleus. Under a fluorescence microscope, cells display condensed nuclei — indicating pyroptosis — and foci of adaptor proteins — indicating inflammasome formation.
For immunofluorochemical analysis of the nigericin-treated cells, wash the probe-labeled cells, and incubate the cells in 250 microliters of fixation and permeabilization solution per well for 30 minutes on ice, protected from light.
Wash the macrophages three more times with fresh wash buffer, and label the cells with 250 microliters of primary antibody against apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain, or ASC, per well for one hour on ice.
Wash the cells at the end of the incubation, and label the samples with 250 microliters of the appropriate fluorescent dye-conjugated secondary antibody for another hour on ice, adding 4 microliters of an appropriate fluorescent nuclear staining dye during the last 5 minutes.
After washing the cells 3 times in cold wash buffer, mount coverslips onto the slides with 7 microliters of anti-fade mounting medium as demonstrated, and image the macrophages by fluorescence confocal microscopy.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van de activatie van het NLRP3-inflammasoom in primaire macrofagen. Het proces omvat de introductie van bacterieel lipopolysacharide en daaropvolgende behandelingen om inflammasoomvorming en pyroptose te visualiseren met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Ontstekingonderzoek
Achtergrond
- Het NLRP3-inflammasoom speelt een cruciale rol in de immuunrespons.
- Activatie van NLRP3 is gekoppeld aan diverse inflammatoire aandoeningen.
- Inzicht in de activatie ervan kan leiden tot nieuwe therapeutische doelwitten.
- Fluorescentiemicroscopie is een krachtig instrument voor het visualiseren van cellulaire processen.
Doel van de studie
- Om het mechanisme van de NLRP3-inflammasoomactivatie te verhelderen.
- Om het gebruik van fluorescentiemicroscopie bij het bestuderen van pyroptose aan te tonen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Kweken van primaire macrofagen.
- Toevoegen van LPS om toll-like receptoren te activeren.
- Gebruik van een ionofoor om kaliumefflux te induceren.
- Immunofluorescentiekleuring om inflammasoomcomponenten te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle activering van NLRP3 en vorming van het inflammasoom.
- Visualisatie van gecondenseerde kernen die duiden op pyroptose.
- Identificatie van adaptereiwitten die geassocieerd zijn met de vorming van het inflammasoom.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol voor het bestuderen van macrofaanresponsen.
Conclusies
- De studie biedt een heldere methodologie voor het onderzoeken van inflammasoomactivatie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van ontstekingsprocessen in macrofagen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere studies naar immuunresponsen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Directe visualisatie van de assemblage van het NLRP3-inflammasoom in primaire macrofagen maakt mechanische risicoreductie mogelijk tijdens de fase van targetvalidatie voor geneesmiddelenonderzoek gericht op inflammatie. Kwantitatieve immunofluorescentie-read-outs ondersteunen het voorspellend vertrouwen in de betrokkenheid van de signaalroute en faciliteren de vroege triage van kandidaat-targets die betrokken zijn bij aangeboren immuunsignalering. Deze workflow versterkt de translationele continuïteit van discovery biologie naar de selectie van preklinische modellen in immunologieportefeuilles.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van NLRP3-activering en complexvorming in ziekte-relevante macrofagen mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door bevestiging van pathway-betrokkenheid op het niveau van het eiwitcomplex.
- Biedt visueel en kwantitatief bewijs voor functionele targetvalidatie.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de modulatie van de aangeboren immuunroute.
Screening en assay-ontwikkeling
- Stelt een gevalideerde immunofluorescentie-assay vast voor het detecteren van inflammasoomassemblage.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor downstream screening-workflows.
- Ondersteunt de standaardisatie en schaalbaarheid van de assay voor de evaluatie van verbindingen die gericht zijn op NLRP3.
- Maakt betrouwbare detectie van pathway-activatie en fenotypes van celdood mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro-bevindingen met ziekterelateerde immuunmechanismen voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Biedt continuïteit van het onderzoek naar cellulaire signaalpaden tot de selectie van preklinische modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de voortgang van programma's gericht op inflammatie.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor de selectie van kandidaten in immunologie-pipelines.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode op basis van immunofluorescentie is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot lead-identificatie en preklinische validatie voor targets van de aangeboren immuniteit.
- Ontdekkingsbiologie: Bevestigt de activering van het NLRP3-pad en de assemblage van het inflammasoom in primaire macrofagen.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor assayontwikkeling en compound-screening.
- Analytiek: Maakt meting van adaptor-proteïnefoci en nucleaire condensatie als functionele outputs mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro onderzoek naar signaalpaden en de selectie van preklinische immuunmodellen.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Biedt een herbruikbaar platform voor het evalueren van interventies gericht op het inflammasoom over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor immunofluorescentie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door pathway-engagement in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van assets gericht op inflammatie mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire macrofaagcultuur en immunofluorescentiemicroscopie.
- Toegang tot confocale beeldvorming en gevalideerde antilichaamreagentia voor de detectie van ASC is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van kleurings- en beeldvormingsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende macrofaagbronnen of ziektemodellen.
- Afhankelijk van een robuuste kwantificering van nucleaire condensatie en eiwitfoci als resultaten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detection of Inflammasome Activation via Fluorescence Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Assessment of the Activation of Multiple Caspases in Macrophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection
Gerelateerde video's
0 Bekeken
"Phagosome Closure Assay" naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026