Waarom is het testen van de nulhypothese belangrijk voor cytokine-assays geïnduceerd door toxinen?

Toetsing van de nulhypothese waarborgt dat waargenomen veranderingen in cytokinen statistisch toeschrijfbaar zijn aan blootstelling aan bacteriële toxinen in plaats van aan toevallige variatie, wat bijdraagt aan een robuuste validatie van het doelwit en mechanistische helderheid.

Hoe past de isolatie van onafhankelijke variabelen in het membraansysteem binnen de discovery-pipeline?

Het isoleren van het effect van uitgescheiden toxines met behulp van het membraansysteem maakt een nauwkeurige toeschrijving van cellulaire responsen mogelijk, wat de vroege ontdekking stroomlijnt en verstorende factoren bij de identificatie van targets vermindert.

Wat maken kwantitatieve cytokine-metingen mogelijk in anti-infectieve R&D?

Kwantitatieve cytokine-metingen leveren bruikbare resultaten op voor het vergelijken van experimentele condities, het informeren van compound-screening en het ondersteunen van datagestuurde beslissingen over de verdere voortgang.

Waarom zijn replicatie-eisen cruciaal voor cross-functionele infectiestudies?

Replicatie waarborgt de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van toxine-geïnduceerde effecten, wat de integratie van gegevens tussen teams vergemakkelijkt en het organisatiebrede vertrouwen in mechanistische bevindingen ondersteunt.

Welke statistische analysemogelijkheden zijn vereist voordat cytokine-uitlezingen worden geïmplementeerd?

Een robuuste statistische analyse is vereist om de significantie van cytokinewijzigingen te valideren, wat een betrouwbare interpretatie en daaropvolgende besluitvorming in de discovery-pipeline mogelijk maakt.

A Permeable Membrane Insert-Based Infection System to Study the Impact of Bacterial Toxins

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 weergaven • 3:28 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Take a two-chambered infection system separated by a permeable membrane insert. The bottom compartment contains adherent human keratinocytes, or skin cells.

Add bacterial pathogens in the upper chamber, and incubate. The membrane prevents direct contact of the pathogens with the keratinocytes. Pathogens secrete streptolysin S or SLS — a small toxin — that crosses the membrane to reach the cells.

The sodium bicarbonate co-transporter on keratinocytes mediates the influx of bicarbonate and sodium ions, maintaining intracellular pH. SLS binds to the co-transporter and disrupts ion transport, leading to intracellular osmotic stress.

The stress-induced downstream signaling causes degradation of the inhibitor bound to sequestered Nuclear Factor-Kappa B, or NF-κB, leading to its activation. The activated NF-κB translocates to the nucleus, leading to the upregulation of pro-inflammatory cytokine production.

Upon extracellular secretion, the cytokines bind to death receptors on the host cell, initiating necrosis. Post-incubation, harvest the culture supernatant to assess the impact of the bacterial toxin.

Immediately prior to treatment, use 1X PBS to wash the cells. Then, apply 2 milliliters of fresh growth medium with or without pharmacological treatment to the six-well plates, or 0.5 milliliters of medium to the wells of 24-well plates. Next, under a laminar flow hood use sterile forceps to carefully place a sterile 0.4-micron permeable membrane insert into each well.

Gentle and sterile handling of the permeable inserts during infection preparation is critical to prevent the membrane from becoming compromised or contaminated during this process.

Apply fresh cell culture medium to the upper chamber of each well, according to the manufacturer's instructions. Then, apply an appropriate volume of the normalized bacterial cultures to the upper chamber of the permeable membrane insert system, and apply bacterial medium to the control wells.

Careful addition of the bacteria to the upper chamber, as well as gentle transport of the infected cells to the incubator, are critical, because it is essential that bacteria do not contaminate the lower chamber during the experimental setup.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

A Permeable Membrane Insert-Based Infection System to Study the Impact of Bacterial Toxins

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Relevantie voor de Industrie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor de implementatie

Veelgestelde vragen over biopharma

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Het ontcijferen van het moleculaire mechanisme en de functie van porievormende toxines met behulp van Leishmania major

Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Extracting Host Cell Lysate from Infected Host Cells Cultured in a Permeable Membrane System

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie