Analysis of Immune Synapses between Human T Cells and SEB-Loaded Raji Cells using Imaging Flow Cytometry
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:28 min • July 8th, 2025
Take flow cytometry tubes containing unloaded Raji cells and Staphylococcus aureus enterotoxin B or SEB-loaded Raji cells.
These SEB-loaded Raji cells function as surrogate antigen-presenting B cells containing the superantigen SEB complexed to class II MHC molecules.
Incubate with pan-leukocytes.
The T cell receptors, TCRs on T cells bind to the SEBs on Raji cells, which, along with co-stimulatory signals, establish a stable cell-cell junction, an immune synapse, leading to T cell activation.
This triggers intracellular signaling pathways, causing the actin cytoskeleton rearrangement, with the clustering of signaling molecules and surface receptors within the synapse.
Post-incubation, fix the cells to preserve their cellular structures. Permeabilize the cells to access intracellular targets.
Add fluorophore-labeled anti-CD3 antibodies, phalloidin, and DAPI, which bind to CD3 in the TCR complex, actin filaments, and DNA, respectively.
Using an imaging flow cytometer, visualize fluorescent signals from CD3 and actin to determine their enrichment at the synapse in the presence of SEB.
Begin by mixing one milliliter of freshly drawn human peripheral blood with 30 milliliters of ACK lysis buffer in a 50-milliliter conical tube. After eight minutes at room temperature, fill the tube with PBS for a centrifugation wash, and resuspend the pellet in two milliliters of culture medium for a 60-minute incubation at 37 degrees Celsius.
At the end of incubation, add 5 x 105 Staphylococcus aureus enterotoxin B or SEB loaded or unloaded Raji cells in 500 microliters of culture medium into individual FACS tubes, followed by 650 microliters of pan-leukocytes. Spin down the co-cultures, and resuspend the pellets in 150 microliters of fresh culture medium for a 45-minute incubation at 37 degrees Celsius.
Then, gently vortex the cells for 10 seconds at 100 RPM while adding 1.5 milliliters of 1.5% paraformaldehyde. After 10 minutes at room temperature, stop the fixation with one milliliter of PBS supplemented with 1% BSA, and collect the cells by centrifugation. Resuspend the pellets in 100 microliters of PBS plus BSA and 0.1% saponin, and add the cell samples to two individual wells of a 96-well U-bottom plate.
After 15 minutes at room temperature, centrifuge the plate and resuspend the pellets in 50 microliters of PBS plus BSA and saponin, containing the fluorophore-conjugated antibodies or compounds of interest for a 30-minute incubation in the dark at room temperature. At the end of the incubation, wash the cells three times in 150 microliters of PBS plus BSA and saponin, and resuspend the pellets in 60 microliters of PBS.
To image the cells by flow cytometry, open the analysis software, check the liquid level, and click Start Up in the instrument menu. Next, click Load, and load the samples into the port when prompted.
Under the Illumination tab, change the excitation laser power to the appropriate nanometer lengths. Then, adjust the gates for channels 4 and 11, and adjust the area for channel 1.
To evaluate the gating and laser power adjustments, switch the View menu to the respective gate, and adjust the gates and laser powers until the cells and cell couples are visible. Then, in the File Acquisition tab, define the sample name, and the number of images to acquire, and the appropriate gate for CD3 staining, and click Acquire to begin the acquisition.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van T-celactivatie met behulp van SEB-geladen Raji-cellen als surrogaatantigeen-presenterende B-cellen. Het proces maakt gebruik van flowcytometrie om de vorming van de immuunsynaps en de interactie van de T-celreceptor te visualiseren.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Raji-cellen kunnen worden geladen met superantigenen zoals SEB.
- T-celactivatie vereist zowel antigeenherkenning als costimulerende signalen.
- Immuunsynapsen zijn cruciaal voor effectieve T-celresponsen.
- Flowcytometrie maakt een gedetailleerde analyse van celinteracties mogelijk.
Doel van de studie
- Om de mechanismen van T-celactivatie te onderzoeken.
- Om de vorming van immuunsynapsen te visualiseren.
- Om de rol van SEB bij de betrokkenheid van de T-celreceptor te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van SEB-geladen en niet-geladen Raji-cellen.
- Co-cultuur van Raji-cellen met pan-leukocyten.
- Fixatie en permeabilisatie van cellen voor antilichaamkleuring.
- Flowcytometrie-analyse om TCR- en actinedynamiek te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van immuunsynapsen tussen T-cellen en SEB-geladen Raji-cellen.
- Visualisatie van CD3- en actine-verrijking bij de synaps.
- Demonstratie van signaalpaden voor T-celactivatie.
- Kwantitatieve analyse van T-celresponsen op SEB.
Conclusies
- SEB-geladen Raji-cellen bootsen antigeenpresenterende cellen effectief na.
- Flowcytometrie is een krachtig instrument voor het bestuderen van T-celinteracties.
- Het begrijpen van de dynamiek van de immuunsynaps is essentieel voor immunologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van de vorming van de immuunsynaps, een kritieke vroege gebeurtenis bij de activatie van T-cellen, wat targetvalidatie bij de ontdekking van immunomodulatoren ondersteunt. Door de verrijking van CD3 en actine te visualiseren via imaging flowcytometrie, biedt het mechanische risicoreductie voor biologics die zich richten op TCR-signaleringspaden. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen van immuuninteractie.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt hypothesen over TCR-afhankelijke signalering door middel van directe visualisatie van de vorming van de immuunsynaps.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door co-stimulerende en antigeenafhankelijke T-celactivatie te bevestigen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicovermindering van immunomodulerende kandidaten mogelijk via kwantitatieve synapsmetrieken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde T-cel-APC-interactiesystemen voor voor downstream compound-screening.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten van synapsvorming voor assay-optimalisatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt schaalbaar platformgebruik in hit-to-lead-progressie voor immunomodulatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door menselijke T-cel-B-cel-interacties in superantigeen-gestuurde pathways te modelleren.
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie via kwantificeerbare dynamiek van de immuunsynaps.
- Strategische waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door vroege target-engagement te koppelen aan functionele T-celresponsen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-engagement screening tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor immunomodulatoren en vaccinjulpstoffen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van TCR-pMHC en co-stimulerende interacties in menselijke immuuncontexten.
- Screening: Levert assay-klare systemen met kwantitatieve imaging-outputs voor de evaluatie van compound-effecten.
- Analytics: Biedt CD3- en actinenrichment-metrieken die vergelijkende analyse over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door de vorming van de menselijke immuunsynaps in vitro te modelleren.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging flowcytometrie-platform voor immuunprofilering over diverse therapeutische gebieden.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit bij T-celactivatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van immuunsynapsmetingen tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele read-outs te verschaffen over de effectiviteit van immunomodulatoren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve gegevens over synapsvorming.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunologie, flowcytometrie en fluorescentiekleuringprotocollen.
- Is afhankelijk van toegang tot imaging flowcytometers en compensatiecontroles voor multicolor panels.
- Vereist standaardisatie van de celvoorbereiding en incubatietijd voor reproduceerbare detectie van synapsen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar primaire immuuncellen of ziekterelateerde cellijnen.
- Wordt beperkt door de noodzaak van levensvatbare cel-coculturen en optimale SEB-laadcondities voor consistente resultaten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunological Synapse Formation Between Helper T Cells and Antigen-Presenting Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Utilizing Bead-Supported Lipid Bilayers to Investigate the Synaptic Output from T Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026