Waarom bioluminescentie meten voor targetvalidatie?

Het meten van bioluminescentie biedt een snelle benadering voor het aantal levensvatbare bacteriën, waardoor een functionele beoordeling van antimicrobiële targets in infectiemodellen mogelijk wordt. Deze correlatie ondersteunt het minimaliseren van risico's bij targetselectie door een consistent challenge-inoculum over verschillende studies heen te garanderen.

Hoe verbetert het isoleren van variabelen de betrouwbaarheid van de discovery-pipeline?

Door gebruik te maken van een genetisch gemodificeerde, hygromycine-resistente BCG lux-stam wordt de variabele van bacteriële levensvatbaarheid geïsoleerd, waardoor verstorende factoren in de resultaten van het infectiemodel worden verminderd. Dit maakt een duidelijkere interpretatie mogelijk van de effecten van verbindingen op het overleven van mycobacteriën.

Wat maken kwantitatieve CFU-metingen mogelijk bij de ontwikkeling van assays?

Kwantitatieve CFU-metingen valideren het bioluminescentiesignaal als een betrouwbare indicator voor levensvatbare bacteriën, wat de standaardisatie van de assay ondersteunt. Deze dual-readout aanpak zorgt voor een nauwkeurige bereiding van het inoculum voor reproduceerbare infectiestudies.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor crossfunctionele samenwerking?

Replicatie van bioluminescentie- en CFU-metingen waarborgt de consistentie van gegevens tussen de microbiologie- en farmacologieteams, wat bijdraagt aan afgestemde go/no-go-beslissingen. Gestandaardiseerde replicatie vermindert de variabiliteit in antimicrobiële screeningsprogramma's op meerdere locaties.

Welke statistische analyse is vereist vóór de implementatie?

Lineaire regressie of correlatieanalyse is nodig om de relatie tussen de bioluminescentie-intensiteit en de CFU-tellingen over verdunningsreeksen vast te stellen. Dit valideert de nauwkeurigheid van de methode voor het kwantificeren van het levensvatbare inoculum voorafgaand aan gebruik in infectiestudies.

Preparation and Quantification of Mycobacterium bovis BCG lux Inoculum for Infection

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 weergaven • 4:06 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin with a defrosted culture of Mycobacterium bovis BCG lux, a genetically modified bioluminescent strain of attenuated Mycobacterium bovis expressing the reporter luciferase enzyme.

Inoculate the suspension into a culture flask containing the antibiotic hygromycin-supplemented growth medium. Incubate. BCG lux harbors the hygromycin-resistant gene, facilitating its survival and growth.

Post-incubation, prepare suitable culture dilutions using a buffer in luminometer tubes. Transfer to the luminometer, loaded with a long-chain aliphatic aldehyde substrate solution. During the run, the aldehyde is injected into the mycobacterial suspension which enters the cells.

Bacterial luciferase catalyzes the oxidation of endogenous reduced flavin mononucleotide and the aldehyde, resulting in blue-green light emission. The measured bioluminescence intensity indicates the metabolic activity of BCG lux and correlates to the measure of viable bacteria or colony-forming units, CFU.

Next, centrifuge the remaining mycobacterial culture. Resuspend the mycobacterial pellet in a buffer containing a non-ionic surfactant to prevent mycobacterial clumping.

Using the bioluminescence measurements, dilute the suspension to obtain the desired cell density. Prepare serial dilutions of mycobacteria and plate them on hygromycin-supplemented nutrient agar plates. Incubate, allowing BCG lux to form colonies.

Calculate CFU to confirm correlation with bioluminescence intensity. The prepared BCG lux inoculum can be used for infection studies.

To begin, defrost a frozen 1.2-milliliter glycerol stock of Mycobacterium bovis BCG lux. The Montreal vaccine strain transformed with the shuttle plasmid PSMT-1 carrying the luxAB genes. In a labeled 250-milliliter Erlenmeyer flask, inoculate 15 milliliters of Middlebrook 7H9 broth with the defrosted 1.2-milliliter aliquot of BCG lux.

Place the flask in a sealed biosafety container, and incubate at 37 degrees Celcius in an orbital shaker incubator at 220 RPM for 72 hours. After incubation, prepare one to 10 dilutions of the culture in phosphate-buffered saline in luminometer tubes. Vortex, and load the luminometer tubes into the luminometer.

Load the substrate 1% n-decyl aldehyde in absolute ethanol into the injector platform and measure the bioluminescence. Convert the bioluminescence to colony-forming units to check the growth of BCG lux culture.

Transfer the culture to a centrifuge tube, and centrifuge at 2,175 times g for 10 minutes at room temperature to pellet the cells. Discard the supernatant into an appropriate disinfectant with known mycobactericidal activity. Wash the cell pellet twice in 50 milliliters of PBS-T by centrifuging at 2,175 times g for 10 minutes to prevent bacterial clumping.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Preparation and Quantification of Mycobacterium bovis BCG lux Inoculum for Infection

Overzicht

Belangrijkste componenten van de studie

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële relevantie voor directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Ondernemingsimpact

Overwegingen bij de implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Modeling Infection in Neonatal Mice Using Encapsulated Bioluminescent Bacteria

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in Insect Larvae

Measurement of the In Vivo Burden of Bacteria Expressing Luciferase in an Insect Larva

Intranasal Immunization with BCG in a Mouse Model

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen