An Assay for Bacterial Extracellular Protein-Mediated Cytotoxicity on PMNs
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:14 min • July 8th, 2025
Take a culture of Staphylococcus aureus, a pathogenic bacteria that secretes leukocidin — a pore-forming toxin — comprising monomeric S and F components.
Pellet the cells and serially dilute the supernatant. Transfer the leukocidin-containing supernatant into a microplate having polymorphonuclear leukocytes, or PMNs, and incubate.
The S component binds to specific transmembrane receptors on PMNs, followed by hetero-oligomerization with the F component to insert into the cell membrane, resulting in pore formation.
The pore causes a decrease in intracellular potassium ions, activating NLR family pyrin domain-containing 3 or NLRP3 protein.
NLRP3 binds to apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain, or ASC, which recruits pro-caspase-1, forming an inflammasome.
Auto-proteolysis converts pro-caspase-1 to active caspase-1, triggering cell death.
Harvest the cells at defined intervals. Add propidium iodide or PI, which enters dead cells through damaged membranes to bind DNA, emitting fluorescence.
Using flow cytometry, quantify PI-stained cells to assess the cytotoxic effect of both leukocidin concentration and incubation time.
Culture S. aureus overnight in appropriate media, using a shaking incubator set at 37 degrees Celsius the day prior to the experiment. Subculture S. aureus by performing a 1 to 100 dilution of overnight bacteria cultures with fresh media. Incubate at 37 degrees Celsius with shaking until bacteria reach early stationary growth phase. After five hours of growth, transfer 1 milliliter of subculture S. aureus into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube, and centrifuge at 5000 g for 5 minutes at room temperature.
Following centrifugation, aspirate supernatants. Pass aspirated supernatants through a 0.22-micron syringe filter into a new 1.5-milliliter microcentrifuge tube, and place on ice. Perform serial dilutions of supernatant with ice-cold media used to culture Staph aureus. Gently add supernatant samples or media alone for negative and positive controls to individual wells of 96-well plate containing PMNs and ice as described earlier.
Gently rock plate to distribute supernatants and wells, and incubate at 37 degrees Celsius. At desired times, remove plate from incubator, and place on ice. Add 300 microliters of ice-cold DPBS containing 1 microliter of Propidium iodide to each flow cytometry tube. Transfer the samples to flow cytometry tubes on ice. For the positive control well, add 20 microliters of 10% Triton X to the sample prior to transferring to a flow cytometry tube. Analyze propidium iodide staining of intoxicated PMNs using flow cytometry.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cytotoxische effecten van leukocidine, een toxine geproduceerd door Staphylococcus aureus, op polymorfnucleaire leukocyten (PNL's). Het mechanisme omvat porievorming in PNL's die leidt tot celdood, beoordeeld via flowcytometrie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Staphylococcus aureus is een pathogene bacterie.
- Leukocidine is een porievormend toxine dat immuuncellen beïnvloedt.
- Inzicht in het mechanisme van leukocidine kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- Flowcytometrie wordt gebruikt om celsterfte te kwantificeren.
Doel van de studie
- Om het mechanisme van leukocidine-geïnduceerde cytotoxiciteit te verduidelijken.
- Om de effecten van de leukocidineconcentratie en incubatietijd op PMN's te beoordelen.
- Om flowcytometrie te gebruiken voor het kwantificeren van celdood.
Gebruikte methoden
- Kweken en verdunnen van Staphylococcus aureus.
- Incubatie van PMN's met supernatant bevattend leukocidine.
- Gebruik van propidiumjodide om dode cellen te kleuren.
- Flowcytometrie om de celviabiliteit te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Leukocidine induceert porievorming in PMN's.
- Celdeath correleert met de leukocidineconcentratie.
- Flowcytometrie kwantificeert de cytotoxische effecten effectief.
- Activatie van het NLRP3-inflammasoom wordt waargenomen.
Conclusies
- Leukocidine van Staphylococcus aureus is cytotoxisch voor PMN's.
- De studie biedt inzicht in het mechanisme van immuunontwijking.
- De bevindingen kunnen helpen bij de ontwikkeling van behandelingen voor infecties veroorzaakt door S. aureus.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Kwantitatieve beoordeling van bacteriële extracellulaire eiwit-gemedieerde cytotoxiciteit op menselijke PMN's maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij de validatie van targets voor infectieziekten. Deze assay biedt voorspellend vertrouwen bij het evalueren van immuunontwijkingsstrategieën door pathogenen, wat vroege beslissingen in de portfolio bij anti-infectieve R&D ondersteunt. Integratie van flowcytometrie-gebaseerde cytotoxiciteitsmetingen versterkt de translationele continuïteit van ontdekking naar de selectie van preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar mechanismen van bacteriële toxinen die de levensvatbaarheid van immuuncellen beïnvloeden.
- Ondersteunt de functionele validatie van eiwitdoelen afkomstig van pathogenen in gastheer-pathogeeninteracties.
- Levert kwantitatieve gegevens voor mechanische risicoreductie van anti-virulentiestrategieën.
- Faciliteert de triage van kandidaatdoelen op basis van cytotoxiciteitsprofielen.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare, kwantitatieve assay vast voor de cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten.
- Standaardiseert flowcytometrie-gebaseerde read-outs voor high-content screening-workflows.
- Maakt een robuuste vergelijking van toxineconcentraties en incubatietijden over verschillende condities mogelijk.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro cytotoxiciteitsgegevens af met ziekte-relevante immuuncelresponsen.
- Ondersteunt de continuïteit van bevindingen uit de ontdekkingsfase naar preklinische infectiemodellen.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van anti-infectieuze kandidaten die gericht zijn op immuunontwijking.
- Biedt mechanisch inzicht voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze assay bevindt zich binnen het continuüm van ontdekking naar prekliniek en slaat een brug tussen mechanistische targetvalidatie en de selectie van translationele modellen voor anti-infectieve programma's.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de cytotoxiciteit van PMN om de functie van bacteriële eiwitten en immuunontwijkingspaden te verduidelijken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare flowcytometrie-outputs voor comparatieve analyse.
- Analytica: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen voor statistische evaluatie van cytotoxische effecten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro immuuncelresponsen met eindpunten van preklinische infectiemodellen.
- Bedrijfsbrede herutilisatie: Biedt een herbruikbaar assayplatform voor diverse bacteriële toxinen en immuunceltypen.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in gastheer-pathogeenstudies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays voor gebruik in verschillende programma's.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroege biologische risicobeoordeling mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van anti-infectieve middelen die gericht zijn op immuunevasie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en de verwerking van immuuncellen.
- Vereist toegang tot gevalideerde instrumentatie en analytische infrastructuur.
- Maakt standaardisatie van assayprotocollen en controles tussen teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan verschillende bacteriële toxines en immuuncelpopulaties door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van hoogwaardige humane PMN's en bacteriële supernatanten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cytotoxicity Assay of Staphylococcus aureus Strains on Neutrophils following Phagocytosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026