Establishing an Infection Model Through Microinjection of Gastric Organoids with Pathogenic Bacteria
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:30 min • July 8th, 2025
Under a stereomicroscope, observe gastric organoids, three-dimensional cellular structures composed of differentiated gastric cells, and stem cells.
Introduce a microinjector loaded with Helicobacter pylori, a gastric pathogen.
Insert the needle into the target organoid and inject the bacterial suspension.
Observe a cloudy solution develop within the lumen.
H.pylori employs a specific adhesin protein on its surface to bind to the gastric cell receptor, establishing a stable interaction between the bacteria and host cells.
This interaction triggers the elongation of the bacterial secretion pilus, a large tunnel-shaped structure that extends toward the host cell membrane.
H.pylori uses the secretion pilus to inject virulence factors, including cytotoxic associated gene A or CagA into the host cell.
Once inside the cell, CagA undergoes phosphorylation by the host cell kinase.
Phosphorylated CagA deregulates multiple intracellular signaling cascades that alter host cell functions, promoting cancerous transformation.
Collect the infected organoids for further analysis.
To begin microinjection of organoids, harvest H. pylori bacteria, and wash them in basal medium according to standard protocols. Following optical density measurements to determine bacterial number, dilute the culture to 1 x 109 bacteria per milliliter in basal medium.
Pull the glass capillary into two injection needles using a micropipette puller, and store in a clean petri dish. Then using forceps, break the tip of one injection needle to produce an opening that is approximately 10 micrometers wide.
Working at a stereomicroscope, set up inside a sterile culture hood, insert the needle into the injection holder, and fix it to the micromanipulator. Take up approximately 10 microliters of the bacterial solution into the needle. Then, place the 4-well cell culture plate containing gastric organoids under the stereomicroscope.
Navigating with the micromanipulator, position the needle close to an organoid. Insert the needle into the organoid with one swift movement, and then, inject approximately 0.2 microliters of bacterial solution into the center of the organoid. With experience, approximately 30 of the largest organoids in a well can be injected in 5 minutes. Incubate the injected organoids for the desired time in a cell culture incubator.
Often, individuals new to this technique will struggle because they find it difficult to efficiently target the organoids. Mouse gastric organoids grow cystic and are the easiest to target. So, injection of mouse gastric organoids with, for example, a dye, may be a good practice for this technique.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het micro-injecteren van Helicobacter pylori in gastrische organoïden om bacteriële gastheer-interacties te bestuderen. De techniek maakt het mogelijk om te observeren hoe H. pylori de functies van de gastheercel beïnvloedt en carcinogene transformatie bevordert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Micro-injectietechnieken
- Biologie van maagorganoïden
- Bacteriële pathogenese
Achtergrond
- Maagorganoïden zijn driedimensionale structuren die zijn afgeleid van maagcellen.
- Helicobacter pylori is een bekend maagpathogeen dat gelinkt is aan kanker.
- De interactie tussen H. pylori en maagcellen omvat specifieke adhesine-eiwitten.
- Het begrijpen van deze interactie is cruciaal voor inzichten in maagziekten.
Doel van de studie
- Om de micro-injectie van H. pylori in maagorganoïden te demonstreren.
- Om de effecten van H. pylori op de signaleringspaden van de gastheercel te analyseren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers die bacteriële infecties in maagweefsels bestuderen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van H. pylori-culturen en het oogsten van organoïden.
- Microinjectie van bacteriële oplossingen in organoïden met behulp van een micromanipulator.
- Observatie van organoïde-reacties onder een stereomicroscoop.
- Analyse van de effecten van geïnjecteerde virulentiefactoren op gastheercellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van H. pylori in gastrische organoïden is gerealiseerd.
- De geïnjecteerde organoïden vertoonden een troebele oplossing, wat duidt op de aanwezigheid van bacteriën.
- Er is aangetoond dat H. pylori de signalering van de gastheercel beïnvloedt via het CagA-eiwit.
- De infectie leidde tot veranderingen in de functies van de gastheercel, wat relevant is voor kankeronderzoek.
Conclusies
- De microinjectietechniek is effectief voor het bestuderen van interacties van H. pylori.
- Gastrische organoïden dienen als een waardevol model voor het begrijpen van maagziekten.
- Deze methode kan verder onderzoek naar bacteriële pathogenese en kanker faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt mechanistische risicoreductie van virulentiefactoren van Helicobacter pylori mogelijk in een fysiologisch relevant menselijk weefselmodel, wat targetvalidatie ondersteunt in pipelines voor gastro-intestinale oncologie en infectieziekten. Door de translocatie van CagA en downstream signaalveranderingen te kwantificeren, biedt het voorspellend vertrouwen voor anti-virulentie therapeutische strategieën. Het op organoïden gebaseerde infectiemodel slaat een brug tussen discovery biology en de preklinische beoordeling van gastheer-pathogeen interacties die relevant zijn voor risicostratificatie bij maagkanker.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de functie van H. pylori adhesinen en secretie-pili bij de pathogenese van het maagepitheel.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van bacteriële virulentiefactoren zoals CagA via directe micro-injectie in organoïde lumen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door bacteriële injectie te koppelen aan deregulatie van gastheercelsignalering en kanker-geassocieerde fenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde infectiemodellen van maagorganoïden voor voor downstream screening van verbindingen of antilichamen die zich richten op de virulentiemechanismen van H. pylori.
- Operationele waarde: Standaardiseert de infectie-efficiëntie via een gecontroleerde bacteriële dosering (1 x 10^9 bacteria/mL) en injectievolume (0.2 µL) voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om door infectie geïnduceerde veranderingen, zoals veranderingen in het cytoskelet en fosforyleringsafhankelijke verschuivingen in de signalering, te meten als assay-eindpunten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door de infectiedynamiek van het menselijke maagepitheel te modelleren, wat de exploratie van translationele biomarkers ondersteunt (bijv. phospho-CagA).
- Operationele waarde: Faciliteert preklinische continuïteit van de validatie van target hits tot de bevestiging van het werkingsmechanisme in een 3D-weefselcontext.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door het kwantificeren van de mechanistische risicoreductie van anti-infectieuze middelen of remmers van oncogene signaalpaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze techniek is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van doelwitvalidatie tot optimalisatie van lead-verbindingen, waardoor mechanistische analyse van bacteriële virulentiefactoren mogelijk is voorafgaand aan preklinische werkzaamheidstests.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van interacties tussen H. pylori en de gastheer door directe aflevering van pathogenen aan het organoïd-epitheel mogelijk te maken voor functionele analyse.
- Screening: Levert assay-klare geïnfecteerde organoïden met kwantificeerbare resultaten, zoals intracellulaire translocatie van virulentiefactoren en veranderingen in gastheersignalering.
- Analytics: Genereert meetbare afhankelijke variabelen, waaronder de fosforyleringsstatus van CagA, modulatie van de signaleringscascade en verschuivingen in de cellulaire morfologie voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt infectiemodellering met preklinische continuïteit door behoud van de gastrische epitheliale architectuur en door pathogenen geïnduceerde transformatiefenotypen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar infectieplatform dat aanpasbaar is voor andere gastrische pathogenen of studies naar virulentiefactoren binnen diverse discovery-projecten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door directe causaliteit aan te tonen tussen de afgifte van bacteriële virulentiefactoren en dysfunctie van de gastheercel.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde micro-injectieparameters en protocollen voor de behandeling van organoïden onder steriele omstandigheden.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit bij antibacteriële of antikanker target-engagement te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van therapeutica die gericht zijn op H. pylori virulentiepaden of downstream oncogene signalering.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in organoïdenkweek, micromanipulatie en steriele weefselbehandelingstechnieken.
- Afhankelijk van micromanipulatorsystemen, de preparatie van glazen capillairen en de infrastructuur voor stereomicroscopische visualisatie.
- Vereist cross-team standaardisatie van het tijdstip van infectie, bacteriële kwantificering en selectiecriteria voor organoïden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende organoïdenspecies (mens vs. muis) en pathogeenstammen met variërende injectie-efficiëntie.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van technische vaardigheden voor consistente targeting van organoïden en potentiële variabiliteit in de efficiëntie van de infectievestiging.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Intragastric Gavage Technique for Controlled Helicobacter Infection in Mice
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Technique to Develop a Parasite Infection in Intestinal Organoids via Microinjection
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Aanpassing van gastro-intestinale organoïden voor pathogene infectie en single cell sequencing onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026