A Technique to Assess the In Vivo Localization of Tumor-Specific Antibodies
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:13 min • July 8th, 2025
Take a human ovarian cancer cell suspension. Add a basement membrane matrix medium, and keep on ice to avoid gel formation.
Load the mixture into a syringe and inject subcutaneously into an athymic nude mouse. Remove the needle once the matrix undergoes gelation, preventing mixture expulsion.
The lack of an immune response in the immunodeficient mouse preserves the viability of the injected cells. The gel's extracellular matrix proteins and growth factors provide growth-promoting signals, facilitating tumor formation.
Tumor cells overexpress surface-bound folate receptor alpha-1, or FOLR1.
Take FOLR1-specific antibodies. Add a fluorescent dye and incubate, allowing dye conjugation with the antibodies.
Intravenously inject the labeled antibodies into the anesthetized tumor-bearing mouse.
Antibodies reach the tumor via circulation and bind to FOLR1 on tumor cells, fluorescently labeling the cell surface.
Perform in vivo fluorescence imaging. Upon excitation, the dye emits fluorescence, facilitating the assessment of antibody localization in the tumor.
Dialyze 0.5 milliliters of the antibody using a dialysis cassette in 1 liter of conjugation buffer. After four hours, transfer the dialysis cassette to fresh buffer, and dialyze overnight. To set up a conjugation reaction, add 0.03 micrograms of IRDye 800CW per 1 milligram of antibody in a total volume of 500 microliters.
Incubate the mixture for two hours at 20 degrees Celsius. Then, purify the labeled conjugates by extensive dialysis against PBS. Estimate the degree of labeling by measuring the absorbance of the dye at 780 nanometers, and absorbance of the protein at 280 nanometers.
To develop mouse xenografts, gently, lift the skin of the animal and separate it from the underlying muscle layer. Slowly inject 100 microliters of cell suspension under the skin with a 26-gauge needle. Wait for a few seconds before taking the needle out so that basement matrix medium can form a semi-solid gel-like structure along with cells under the skin, which will prevent the mixture from coming out of the injection site.
To perform in vivo imaging, inject the dye-labeled antibody via the tail vein. After anesthetizing the mouse, check for the lack of response to pedal reflexes, and dilate the vein by applying warm water. Use a 1 CC insulin syringe with a 26-gauge needle to inject 25 micrograms of the labeled antibody in a volume of 100 microliters. As a negative control, label and inject the non-specific IgG isotype antibody which does not target cancer cells.
Perform in vivo imaging 8, 24, and 48 hours after antibody injections. In the imaging software, click Initialize. Confirm that the stage temperature is 37 degrees Celsius. In the control panel, set up fluorescence imaging through the imaging wizard, and set the excitation to 773 nanometers, and emission to 792 nanometers.
Transfer the anesthetized mouse into the imaging chamber and position it on the imaging field using the nose cone. When ready, click Acquire on the control panel for the image acquisition, and click Auto Expose. The generated image is the overlay of the fluorescence on the photographic image, with optical fluorescence intensity displayed in units of counts or photons.
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het ontwikkelen van muisxenografts met menselijke eierstokkankercellen en belicht het gebruik van FOLR1-specifieke antilichamen voor in vivo imaging. De benadering maakt het mogelijk om de lokalisatie van antilichamen in tumoren te beoordelen via fluorescentie-imaging.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- Menselijke eierstokkankercellen kunnen worden geïnjecteerd in immuundeficiënte muizen voor studies naar tumorvorming.
- De extracellulaire matrix biedt essentiële groeisignalen voor tumorontwikkeling.
- FOLR1 is overgeëxpresseerd in eierstokkankercellen, waardoor het een doelwit is voor beeldvorming.
- Fluorescent gelabelde antilichamen kunnen worden gebruikt om tumorcellen in vivo te visualiseren.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een betrouwbare methode voor het creëren van muisxenografts van menselijke eierstokkankercellen.
- Het benutten van FOLR1-specifieke antilichamen voor de beeldvorming van tumorcellen.
- Het beoordelen van de lokalisatie van antilichamen in tumoren via fluorescentie-beeldvormingstechnieken.
Gebruikte methoden
- Injectie van een basaalmembraanmatrix met eierstokkankercellen in athyme nude-muizen.
- Conjugatie van een fluorescerende kleurstof aan FOLR1-specifieke antilichamen.
- In vivo imaging uitgevoerd op meerdere tijdstippen na injectie.
- Gebruik van een control non-specifiek IgG-isotype-antilichaam voor vergelijking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van tumoren in immuundeficiënte muizen na celinjectie.
- Fluorescerende beeldvorming bevestigde de lokalisatie van gelabelde antilichamen bij tumorcellen.
- Beeldvormingsresultaten demonstreerden de effectiviteit van de geconjugeerde antilichamen bij het visualiseren van de aanwezigheid van tumoren.
- Controle-experimenten met aspecifieke antilichamen toonden een minimale binding aan tumorcellen.
Conclusies
- De methode die is vastgesteld voor het creëren van xenografts is effectief voor het bestuderen van menselijke eierstokkanker.
- FOLR1-specifieke antilichamen zijn een waardevol hulpmiddel voor in vivo beeldvorming van tumoren.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar kankerdiagnostiek en therapeutica faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze techniek stelt biofarmaceutische teams in staat om de specificiteit van tumor-targetende antilichamen in vivo te valideren, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie. Door de lokalisatie van antilichamen in xenograftmodellen te kwantificeren, biedt het voorspellend vertrouwen voor de selectie van lead-kandidaten en vermindert het biologische uitval in een laat stadium. De workflow ondersteunt translationele continuïteit van discovery tot preklinische evaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt de target-interactie van FOLR1-specifieke antilichamen in levende tumormodellen.
- Operationele waarde: Maakt directe visualisatie van antilichaambinding aan overexpressie van oppervlaktereceptoren mogelijk.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen op basis van de efficiëntie van de in vivo lokalisatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen voor de interactie tussen antilichaam en tumor.
- Reproduceerbaarheid: Een gestandaardiseerd beeldvormingsprotocol maakt een consistente vergelijking tussen antilichaamkandidaten mogelijk.
- Schaalbaarheid: Compatibel met gemultiplexte testen van gelabelde antilichaampanels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Maakt gebruik van menselijke eierstokkanker-xenografts die FOLR1 tot expressie brengen, een klinisch relevant doelwit.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bindingsgegevens en in vivo tumoraccumulatie.
- Risicobeperking: Identificeert aspecifieke binding in een vroeg stadium via IgG-isotypecontroles.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm en ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen via functionele validatie van tumorspecifieke antilichaamkandidaten voorafgaand aan de preklinische optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Test biologische hypothesen over receptor-gemedieerde tumor-targeting in vivo.
- Screening: Biedt een op imaging gebaseerde read-out voor de lokalisatie en retentie van antilichamen.
- Analytica: Levert kwantitatieve fluorescentie-intensiteitsmetingen op meerdere tijdstippen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarker-gestuurde strategieën die FOLR1 als therapeutisch doelwit gebruiken.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van tumorspecifieke antilichamen voor diverse indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie door direct bewijs van in vivo targetbinding.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflow voor conjugatie, dosering en beeldvorming.
- Strategische waarde: Ondersteunt de prioritering van de portfolio met functionele in vivo data.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk van antilichaam-leads met bevestigde tumorlokalisatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in antilichaamlabeling, xenograft-modellering en in vivo imaging.
- Is afhankelijk van fluorescente imaging-infrastructuur met passende excitatie-/emissiesinstellingen.
- Necessiteert gestandaardiseerde protocollen voor antilichaamconjugatie en -zuivering.
- Omvat cross-functionele coördinatie tussen teams voor biologie, imaging en farmacologie.
- Beperkt tot antigeen-positieve modellen; vereist validatie van targetexpressie in xenografts.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Labeling Murine T Helper Lymphocytes using Radiolabeled Monoclonal Antibodies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vivo Immunofluorescence Localization Method to Study Antibody Biodistribution
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vivo Fluorescence Imaging to Localize Antibodies in a Mouse Tumor Xenograft Model
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vivo PET Imaging Technique to Detect Tumors in a Murine Model Using Radiolabeled Antibodies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vivo Technique to Track Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking to Tumors
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Muizen-lymfocyt Labeling door 64 Cu-Antibody Receptor targeting voor In Vivo Celverkeer PET / CT
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026