Detection of Vitronectin Binding to Bacterial Surfaces using Flow Cytometry
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:05 min • July 8th, 2025
Take flow cytometer tubes containing wild-type and mutant strains of Haemophilus influenzae, type f.
Pipette a buffer containing blocking proteins and vitronectin. Incubate.
The blocking proteins reduce non-specific interactions on the bacterial surface, while vitronectin molecules bind to protein H, a vitronectin-binding protein, on wild-type bacterial surfaces. In the mutant strain, vitronectin does not bind due to the absence of protein H.
Centrifuge. Remove unbound vitronectin and blocking proteins.
Add a buffer containing primary anti-vitronectin antibodies, which specifically bind to vitronectin attached to the wild-type bacterial surfaces.
Next, introduce fluorophore-conjugated secondary antibodies, which bind to the primary antibodies on vitronectin and facilitate vitronectin detection.
Centrifuge. Remove unbound secondary antibodies. Resuspend bacteria in the buffer.
Perform flow cytometry to determine vitronectin binding to the bacterial surface.
Compare the fluorescence signals of wild-type and mutant strains. A shift in the fluorescence signal in wild-type bacteria confirms vitronectin binding to the bacterial surface.
To prepare for flow cytometry, resuspend the bacterial pellets with 50 microliters of blocking buffer containing 250 nanomolar vitronectin. Then, incubate the samples for 1 hour at room temperature without shaking. After incubation, pellet the bacteria by centrifugation at 3,500 x g for 5 minutes. Then wash the pellets three times using PBS and similar centrifugation steps.
Following wash, add 50 microliters of primary sheep anti-human vitronectin polyclonal antibodies to the bacterial pellet, at a 1 to 100 dilution in PBS/BSA. Incubate the suspension for 1 hour at room temperature. Then, wash the bacteria three times with PBS to remove unbound antibodies.
Next, add 50 microliters of PBS/BSA containing fluorescein isothiocyanate-conjugated donkey anti-sheep polyclonal antibodies to the pellet. Incubate at room temperature for 1 hour in the dark. Finally, after three washing steps, resuspend the bacterial pellet with 300 microliters of PBS, and analyze by flow cytometry.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de binding van vitronectine aan wild-type en mutante stammen van Haemophilus influenzae, type f, met behulp van flowcytometrie. De aanwezigheid van proteïne H in wild-type stammen maakt binding van vitronectine mogelijk, terwijl mutante stammen deze interactie missen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Immunologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Haemophilus influenzae is een belangrijk bacterieel pathogeen.
- Vitronectine is een glycoproteïne dat betrokken is bij diverse biologische processen.
- Proteïne H is cruciaal voor de binding van vitronectine in wildtype-stammen.
- Inzicht in deze interacties kan therapeutische strategieën informeren.
Doel van de studie
- Om de binding van vitronectine aan bacteriële oppervlakken te beoordelen.
- Om de binding tussen wildtype- en mutantstammen te vergelijken.
- Om flowcytometrie te gebruiken voor het kwantificeren van bindingsinteracties.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bacteriële stammen en incubatie met blocker-eiwitten.
- Gebruik van primaire en secundaire antilichamen voor de detectie van vitronectine.
- Centrifugatie- en wasstappen om gebonden eiwitten te isoleren.
- Flowcytometrie-analyse om fluorescentiesignalen te meten.
Belangrijkste resultaten
- Wild-type stammen vertoonden significante binding aan vitronectine.
- Mutante stammen vertoonden geen binding door het ontbreken van proteïne H.
- Verschuivingen in het fluorescentiesignaal bevestigden de bindingsinteracties.
- Flowcytometrie kwantificeerde de verschillen effectief.
Conclusies
- Vitronectinebinding is afhankelijk van de aanwezigheid van proteïne H.
- Flowcytometrie is een waardevol instrument voor het bestuderen van bacteriële interacties.
- Deze bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrip van bacteriële pathogenese.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve detectie van de binding van vitronectine aan bacteriële oppervlakken via flowcytometrie maakt een nauwkeurige analyse van gastheer-pathogeeninteracties op moleculair niveau mogelijk. Deze benadering ondersteunt de validatie van targets in een vroeg stadium en het mechanistische risicobeheer voor portfolio's voor de ontdekking van anti-infectiva. Betrouwbare metingen van eiwit-ligandinteracties dragen bij aan de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van kandidaten en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe beoordeling mogelijk van de functie van bacteriële oppervlakte-eiwitten bij het bemiddelen van de binding van gastheerenfactoren.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door wild-type fenotypes te onderscheiden van mutante fenotypes op basis van kwantitatieve bindingsgegevens.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor anti-adhesie- of anti-serumresistentiestrategieën.
Screening & assay-ontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare, kwantitatieve assay vast voor het evalueren van bacteriële oppervlakte-interacties met gastheerproteïnen.
- Biedt gestandaardiseerde fluorescentiegebaseerde uitlezingen die geschikt zijn voor comparatieve analyse tussen stammen of condities.
- Maakt downstream screening van inhibitoren of modulatoren van proteïne-ligandbinding mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro bindingsgegevens uit met ziekterelateerde mechanismen van bacteriële adhesie en immuunontwijking.
- Ondersteunt de continuïteit van moleculaire ontdekking tot preklinische modelvalidatie van anti-infectieuze targets.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten die zich richten op de interface tussen gastheer en pathogeen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op flowcytometrie gebaseerde detectiemethode is geïntegreerd in het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek voor anti-infectieve R&D.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de binding van specifieke gastheerproteïnen aan bacteriële targets, waardoor mechanistische hypothesen worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-outputs voor vergelijking tussen verschillende stammen of verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen voor robuuste statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen moleculaire bevindingen en ziekterelevante bacteriële fenotypes.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Biedt een platformassay die aanpasbaar is aan diverse bacteriële stammen en gastheersfactoren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie en mechanistisch begrip.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie van eiwit-ligandinteracties voor reproduceerbare, schaalbare workflows.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen anti-infectieve portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten die gericht zijn op bacteriële adhesie of serumresistentie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en antilichaamgebaseerde detectie.
- Toegang tot gevalideerde antilichamen en cytometrie-instrumentatie met fluorescentiecapaciteiten is noodzakelijk.
- Vereist strikte standaardisatie van assaycondities en controles tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse bacteriële stammen met passende expressie van oppervlakte-eiwitten.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van hoogwaardige reagentia en een consistente monsterbereiding.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescentie In situ Hybridisatie (LNA flow-FISH): een methode voor Bacteriële Kleine RNA-detectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Assay to Study the Role of Vitronectin in Bacterial Adherence to Host Epithelial Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026