Evaluating Cytotoxicity and Membrane Integrity in Lung Slices via Lactate Dehydrogenase Assay
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:58 min • July 8th, 2025
Begin with human precision-cut lung slices, PCLS, treated with cytotoxic agents like surfactant molecules in a multiwell plate.
The surfactant inserts into the lipid bilayer of the cell, causing the hydrophobic tails of the surfactant to interact with the hydrophobic core of the lipid bilayer.
Consequently, the orderly arrangement of the lipid molecules is disturbed, leading to the formation of a micelle.
This compromises the membrane integrity, causing the leakage of intracellular contents including, lactate dehydrogenase or LDH, a common indicator of cell membrane damage.
Collect the supernatant containing the released LDH.
Add the LDH assay reaction cocktail containing lactate substrate, NAD+, diaphorase, and tetrazolium salt, and incubate.
LDH oxidizes lactate to pyruvate, with simultaneous reduction of NAD+ coenzyme to NADH.
Diaphorase utilizes the NADH to reduce the tetrazolium salt into formazan — a colored product.
Surfactant-induced cytotoxicity can be measured from LDH activity indicated by the formazan production.
After incubating the PCLS with or without test agents, transfer 50 microliters of supernatant and duplicates into a new 96-well plate. This generates duplicates from each treated well of a 24-well plate.
Immediately before the assay, prepare a master-mix of the working solution of LDH reagent by thoroughly mixing 125 microliters of catalyst solution with 6.25 milliliters of dye solution for a 96-well plate. Then, pipette 50 microliters of the master-mix working solution into each well already containing 50 microliters of supernatant, and incubate the plate for 20 minutes at room temperature in the dark. Afterward, measure the absorption of each well at 492 nanometers using a microplate reader, and subtract the absorption at 630 nanometers reference from that at 492 nanometers.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cytotoxische effecten van surfactantmoleculen op precisie-gesneden longplakjes (PCLS). Door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) te beoordelen, kan de integriteit van de celmembranen worden geëvalueerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Celmembraanintegriteit
- Beoordeling van cytotoxiciteit
- Longweefselanalyse
Achtergrond
- Precisie-gesneden longplakjes (PCLS) worden gebruikt om reacties van longweefsel te bestuderen.
- Surfactanten kunnen lipide dubbellagen verstoren, wat de cellevensvatbaarheid beïnvloedt.
- LDH is een veelgebruikte biomarker voor schade aan het celmembraan.
- Het meten van de LDH-activiteit biedt inzicht in cytotoxische effecten.
Doel van de studie
- Om de impact van surfactantmoleculen op longcelmembranen te evalueren.
- Om cytotoxiciteit te kwantificeren via LDH-vrijgave.
- Om een methode vast te stellen voor het beoordelen van de membraanintegriteit in PCLS.
Gebruikte methoden
- Behandeling van PCLS met surfactantmoleculen in een multiwellplaat.
- Meting van de LDH-activiteit in het supernatant na behandeling.
- Gebruik van een colorimetrische assay om de LDH-activiteit te kwantificeren.
- Absorbantiemeting bij specifieke golflengten om de resultaten te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Behandeling met surfactant leidde tot een significante LDH-vrijgave, wat wijst op membraanschade.
- De colorimetrische assay kwantificeerde de LDH-activiteit effectief.
- De resultaten tonen het cytotoxische potentieel van surfactanten op longcellen aan.
- De methodologie biedt een betrouwbare aanpak voor het beoordelen van de cytotoxiciteit in longweefsel.
Conclusies
- Surfactanten tasten de integriteit van het celmembraan in PCLS aan.
- LDH-vrijgave dient als een waardevolle indicator voor cytotoxiciteit.
- De studie draagt bij aan het begrip van de respons van longcellen op cytotoxische agentia.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het beoordelen van de membraanintegriteit en cytotoxiciteit in precisie-gesneden menselijke longplakjes biedt een fysiologisch relevant model voor toxicologische screening van de longen in een vroeg stadium. Kwantitatieve LDH-releasemetingen maken mechanistische risicoanalyse van surfactant-achtige verbindingen mogelijk en ondersteunen targetvalidatie in programma's voor ademhalingsziekten. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door in vitro bevindingen te koppelen aan responsen van menselijk weefsel.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de door surfactant geïnduceerde membraandestructie in menselijk longweefsel te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via LDH-release als biomarker voor het cytotoxische mechanisme.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door verbindingen met longspecifiek cytotoxisch potentieel vroeg in de ontdekkingsfase te identificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen met behulp van gestandaardiseerde LDH-output.
- Reproduceerbaarheid: Levert kwantitatieve, colorimetrische metingen die geschikt zijn voor aanpassing aan high-throughput screening.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform over bibliotheken van surfactant-achtige verbindingen met consistente bemonstering en detectie van het supernatant.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van nauwkeurig gesneden menselijke longcoupes om de ziekterelateerde systeemgetrouwheid te behouden, van ontdekking tot preklinische evaluatie.
- Mechanistische risicoreductie: Koppelt het verlies van membraanintegriteit aan cytotoxische uitkomsten, waardoor ambiguïteit bij pulmonale veiligheidsbeoordelingen wordt verminderd.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve drempelwaarden te bieden voor LDH-vrijgave in longweefselmodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De LDH-assay is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege biologie tot lead-identificatie, en biedt kwantitatieve read-outs voor cytotoxiciteit die bijdragen aan de prioritering van verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van membraanverstorende mechanismen in menselijk longweefsel.
- Screening: Levert assay-klare supernatten met reproduceerbare LDH-activiteitsmetingen voor compound-screening.
- Analytica: Genereert formazan-gebaseerde colorimetrische output bij 492 nm, wat statistische vergelijking van behandelcondities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit door het gebruik van precisie-gesneden menselijke longplakjes, een ziekterelevant systeem voor pulmonale toxiciteit.
- Herbruikbaarheid voor ondernemingen: Vestigt een herbruikbaar cytotoxiciteitsplatform dat toepasbaar is op surfactant-achtige compounds binnen respiratoire programma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door het verlies van membraanintegriteit in een menselijk weefselmodel te kwantificeren.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via een gedefinieerde overdracht van het supernatant, het mengen van reagentia en absorptiemetingen bij twee golflengten.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van cytotoxische verbindingen bij longgerichte discovery.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering via LDH-releusedrempels die beslissingen over verdere ontwikkeling sturen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van precisie-gesneden longplakjes en de omgang met cytotoxische agentia.
- Is afhankelijk van de capaciteit van de microplatereader voor absorptiemetingen bij 492 nm en een referentie bij 630 nm.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de verzameling van supernatant en het vullen van dubbele wells voor de consistentie van de assay.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het uitbreiden van de assay naar niet-longweefselmodellen of alternatieve cytotoxische mechanismen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de stabiliteit van LDH in het supernatant en interferentie door gekleurde testverbindingen die de absorptiemetingen beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Toegang tot de cytotoxiciteit en celrespons op biomaterialen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Lactate Dehydrogenase Release Assay To Detect Macrophage Death Following Nigericin Exposure
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Assay to Measure Chemically-Induced Cytotoxicity in Human Precision-Cut Lung Slices
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026