A Size Exclusion Chromatography Technique to Purify Mycobacterial Extracellular Vesicles
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:38 min • July 8th, 2025
Take a size exclusion chromatography column packed with an inert matrix of polysaccharide resin particles. The porous particles have a defined pore size.
Flush the column with an equilibration buffer for optimal purification.
Add a concentrated culture filtrate processed from a culture of Mycobacterium tuberculosis — a pathogenic bacteria. The filtrate contains extracellular vesicles, or EVs, and other soluble proteins secreted by the bacteria.
EVs are heterogeneously sized, small, spherical structures. They contain macromolecules and virulence factors enclosed in a lipid bilayer.
The sample enters the matrix under gravity. Add the buffer to allow sample movement through the column.
The EVs cannot enter the resin due to the small pore size and instead move through the interparticle space, traveling a shorter path and eluting first.
Proteins, having a smaller size, enter the pores, travel a longer path through the resin, and elute at the end.
Collect the fractions containing EVs for downstream analysis.
Allow the size exclusion chromatography, or SEC column, to equilibrate to room temperature. Turn on the AFC using the power switch on the back of the tower unit, and press SETUP on the main menu touchscreen if necessary to adjust the settings for the load cell. From the SETUP screen, align the carousel by selecting CAROUSEL followed by CALIBRATE. Insert the carousel with the 13 small holes facing up into the AFC tower, and adjust the carousel by pressing the minus or plus buttons so that the fluid nozzle is directly above the flush position.
Remove the caps from the equilibrated SEC column, and slide the SEC column into the appropriate column mount. Carefully install it on the AFC tower. Ensure that the radio frequency identification tag on the column faces the AFC, and check that the connection between the column and the valve is secure. Place the waste outlet tubing in a collection container. From the SETUP screen, select Collection Schedule, and set the count to 13, and the size to 0.5 milliliters by pressing the minus or plus buttons.
Leave the buffer volume setting as the default of 2.7 milliliters, and then, close the Collection Schedule window. Select Start Collection from the home screen, and confirm the collection parameters by selecting Yes. Load 13 labeled 1.7-milliliter microcentrifuge tubes with the lids open, and pointing toward the carousel center. Advance the AFC by selecting OK. Then, mount the column reservoir, and advance again by pressing OK.
Select the option to flush the column by pressing, Yes, and add one column volume of 0.2-micrometer-filtered PBS to remove any storage buffer. Once the flush is complete, advance the AFC by pressing OK. Place the carousel cover over the AFC, and press OK. Use a pipette to remove any excess buffer from the column. Bring 3 milligrams of 100R sample to 500 microliters with 1x PBS, and add the sample to the top of the column.
Prepare one column volume of 0.2-micrometer-filtered PBS. Advance the AFC, and allow the sample to run into the frit. Once the sample has fully entered the column, add the PBS prepared earlier to the reservoir. Monitor the run of the AFC while it collects first the void volume, and then, the specified fractions. After the run completes, and the carousel returns to the waste position, remove the cover and the fraction tubes from the carousel.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail het proces voor het zuiveren van extracellulaire blaasjes (EV's) uit Mycobacterium tuberculosis met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De methodologie belicht de scheiding van EV's van oplosbare eiwitten op basis van grootte, wat verdere analyses faciliteert.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Extracellulaire vesikels (EV's) zijn kleine, bolvormige structuren die door bacteriën worden uitgescheiden.
- Mycobacterium tuberculosis is een pathogene bacterie die bekend staat om zijn virulentiefactoren.
- Size exclusion chromatography is een techniek die wordt gebruikt om moleculen op basis van grootte te scheiden.
- Het begrijpen van EV's kan inzicht verschaffen in bacteriële communicatie en pathogenese.
Doel van de studie
- Om EV's uit Mycobacterium tuberculosis te zuiveren voor verdere analyse.
- Om de effectiviteit van grootte-uitsluitingschromatografie aan te tonen bij het scheiden van EV's van andere eiwitten.
- Om de studie naar de rol van EV's bij bacteriële virulentie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een grootte-uitsluitingschromatografiekolom met polysaccharidehars.
- Doorspoelen van de kolom met een equilibratiebuffer.
- Laden van geconcentreerd cultuurfiltraat met EV's op de kolom.
- Verzamelen van fracties op basis van grootte voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- EV's werden succesvol gescheiden van oplosbare eiwitten met behulp van SEC.
- Fracties die EV's bevatten werden verzameld voor verdere studie.
- De methodologie demonstreerde de efficiëntie van SEC bij het zuiveren van EV's.
- Inzichten in de compositie van EV's werden verkregen door de analyse van de verzamelde fracties.
Conclusies
- Size-exclusionchromatografie is een effectieve methode voor het zuiveren van EV's uit Mycobacterium tuberculosis.
- De studie vergroot het begrip van de rol van EV's bij bacteriële pathogenese.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische toepassingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De zuivering van extracellulaire blaasjes (EV's) van Mycobacterium tuberculosis met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voorziet in een kritische behoefte aan hoogzuivere blaasjespreparaten voor onderzoek naar infectieziekten in een vroeg stadium. Deze techniek maakt een betrouwbare isolatie van EV's mogelijk voor downstream moleculaire karakterisering, wat mechanistische studies en doelwitvalidatie in trajecten van pathogeen-gastheerinteracties ondersteunt. SEC-gebaseerde EV-zuivering vergroot het voorspellende vertrouwen in translationeel onderzoek door gestandaardiseerde, reproduceerbare inputs voor functionele assays te leveren.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Maakt de isolatie van intacte EV's mogelijk voor het onderzoeken van bacteriële communicatiepaden.
- Ondersteunt functionele target-validatie door zuivere vesikelpopulaties te leveren voor mechanistische studies.
- Faciliteert biologische risicoreductie door proteïnecontaminatie in vesikelpreparaten te minimaliseren.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen in downstream-assays met pathogenen-afgeleide vesikels.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde EV-fracties voor de ontwikkeling en optimalisatie van assays.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van screening-workflows op basis van blaasjes.
- Levert kwantitatieve, op grootte gebaseerde scheiding ter ondersteuning van een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor de zuivering van blaasjes uit diverse bacteriële stammen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt blaasjespreparaten af op ziekte-relevante modellen voor translationele biomarkerstudies.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van hoogwaardige EV's.
- Vermindert het risico bij de verdere ontwikkeling van blaasjesgerelateerde targets door monsterzuiverheid en consistentie te waarborgen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie in onderzoekspijplijnen voor infectieziekten.
Pipeline- & Workflowintegratie
EV-zuivering op basis van SEC bevindt zich op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en levert cruciale input voor targetvalidatie, mechanistische studies en de ontwikkeling van assays.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking mogelijk door vesicles te isoleren met minimale contaminanten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve EV-fracties voor assay-gereedheid en compound-screening.
- Analytics: Ondersteunt downstream moleculaire en functionele analyses door goed gekarakteriseerde vesicle-monsters te leveren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vesicle-studies in de ontdekkingsfase met preklinische biomarker- en functionele validatie.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een herbruikbare purificatieworkflow die aanpasbaar is aan diverse bacteriële systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies op basis van blaasjes.
- Operationele waarde: Standaardiseert de zuivering van EV voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over projecten heen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door hoogwaardige inputs voor functionele assays te garanderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van blaasjes-gerelateerde targets en programma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chromatografische technieken en vesikelbiologie.
- Toegang tot SEC-instrumentatie en infrastructuur voor fractieopvang is noodzakelijk.
- Standaardisatie van zuiveringsprotocollen tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende bacteriële stammen, rekening houdend met de heterogeniteit van de vesikelgrootte.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige kalibratie en monitoring van de kolomprestaties.
Biofarmaceutische FAQ's
Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Siderophore-Containing Extracellular Vesicles from Mycobacterium tuberculosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Bacterial Extracellular Vesicles Using Size-Exclusion Chromatography
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A Technique to Separate Heterogenous Population of Gram-Negative Bacterial Outer Membrane Vesicles Based on Their Size
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026