A Peptide-MHC-I Tetramer Staining Technique to Analyze SIV-Specific CD8+ Memory T Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:25 min • July 8th, 2025
Take non-human primate peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, containing CD8+ memory T cells against simian immunodeficiency virus or SIV.
Add a protein kinase inhibitor to prevent internalization of the T cell receptor, or TCR upon subsequent stimulation.
Introduce peptide-major histocompatibility complex class I, or pMHC-I tetramers, fluorophore-conjugated complexes comprising four MHC-I molecules bound to SIV-specific peptides. These peptides bind to TCRs on the surface of T cells.
Add a mixture containing fluorophore-conjugated antibodies binding to CD8, CD28, and CCR7 — markers delineating memory T cell subsets — and antibodies labeling non-CD8+ cells.
A fluorescent viability dye labels dead cells.
Fix the cells. Permeabilize them to access intracellular targets.
Add fluorophore-conjugated antibodies binding CD3, a T cell marker, and intracellular granzyme B, an activated CD8+ T cell marker.
Using flow cytometry, exclude non-CD8+ T cells and dead cells.
Gate pMHC-I tetramer positive CD8+ T cells to characterize different memory CD8+ T cell subsets based on granzyme B, CD28, and CCR7 levels.
Begin by resuspending the Rhesus PBMCs in R-10 medium at a 1.6 times 10 to the seventh cells per milliliter concentration. Aliquot 50 microliters of cells to the appropriate number of flow cytometry tubes, and add 50 microliters of protein kinase inhibitor to each tube. Vortex each tube, and incubate the samples at 37 degree Celsius for 30 minutes.
The correct amount of titrated peptide MHC tetramer must be diluted enough master mix to stain all of the experimental tubes. Therefore, it is important to prepare a 15% excess of the master mix to account for pipetting errors.
While the cells are incubating, pellet the protein aggregates and the tetramer solution by centrifugation to minimize the background staining. Next, dilute the tetramers in enough stain buffer so that 25 microliters of the tetramer master mix can be added to each flow cytometry tube. Then, vortex the sample tubes, and incubate the PBMC tetramer solutions in the dark at room temperature for 45 minutes. At the end of the incubation, add 50 microliters of staining mastermix to the appropriate sample tubes, and mix the tubes by vortexing.
After 25 minutes in the dark at room temperature, wash the cells with wash buffer, pellet the cells by centrifugation, and carefully decant the supernatant without disturbing the pellets. Vortex the cells in the leftover buffer in each tube, and fix the samples with 250 microliters of 2% paraformaldehyde per tube. Immediately vortex and incubate the tubes in the dark at 4 degrees Celsius. After 20 minutes, wash the cells in fresh wash buffer, pellet the cells by centrifugation, and decant the supernatant without disturbing the pellet.
Resuspend the cells in 500 microliters of permeabilization buffer, vortex, and incubate at room temperature for 10 minutes in the dark. Then, wash and pellet the cells. Then, decant the supernatants, as described previously. Proceed to adding 50 microliters of intracellular stain master mix to the appropriate tubes. Vortex each sample and incubate at room temperature in the dark for 30 minutes. After the incubation is done, wash and pellet the cells. The samples are now ready to be acquired in a flow cytometer.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het karakteriseren van CD8 + geheugen T-cel subsets bij niet-menselijke primaten met behulp van flowcytometrie. Het protocol omvat het gebruik van pMHC-I tetrameren en diverse antilichamen om T-celpopulaties te identificeren en te analyseren.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- CD8 + T-cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons tegen virale infecties.
- Inzicht in T-celgeheugensubsets kan waardevolle informatie verschaffen voor de ontwikkeling van vaccins en immunotherapie.
- Flowcytometrie is een krachtig instrument voor het analyseren van celpopulaties op basis van oppervlakte- en intracellulaire markers.
- pMHC-I tetrameren zijn essentieel voor het identificeren van antigeenspecifieke T-cellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het isoleren en karakteriseren van CD8 + geheugen T-cellen uit PBMC's van niet-menselijke primaten.
- Het beoordelen van de activatiestatus van T-cellen met behulp van granzym B en andere markers.
- Het verbeteren van het begrip van T-celresponsen op het simian immunodeficiëntievirus (SIV).
Gebruikte methoden
- Isolatie van PBMC's uit niet-menselijke primaten.
- Gebruik van proteïnekinase-remmers om TCR-internalisatie te voorkomen.
- Kleuring met pMHC-I tetrameren en fluorofoor-geconjugeerde antilichamen.
- Flowcytometrische analyse om T-cel-subsets te karakteriseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van CD8 + geheugen T-cel subsets op basis van granzyme B-, CD28- en CCR7-niveaus.
- Aantoonde de effectiviteit van pMHC-I tetrameren bij het isoleren van SIV-specifieke T-cellen.
- Voorzag in een gedetailleerd protocol voor toekomstige studies naar T-celresponsen.
- Benadrukte het belang van juiste controles en kleuringstechnieken bij flowcytometrie.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is een waardevol instrument voor het bestuderen van de T-celimmuniteit bij niet-menselijke primaten.
- De inzichten uit deze studie kunnen bijdragen aan vaccinatiestrategieën tegen SIV en aanverwante virussen.
- Verder onderzoek is nodig om de functionele implicaties van de geïdentificeerde T-celpopulaties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Nauwkeurige identificatie en karakterisering van antigenspecifieke CD8+ geheugen T-cellen is cruciaal voor het verminderen van risico's bij immunologische targets en het informeren van vaccin- en immunotherapiestrategieën in preklinische modellen. De peptide-MHC-I tetrameer-kleuringstechniek maakt een betrouwbare kwantificering en fenotypering van SIV-specifieke T-cel-subsets mogelijk, wat predictieve immuunmonitoring en translationele continuïteit ondersteunt. Deze capaciteit versterkt de workflows voor vroege ontdekking en targetvalidatie voor portfolio's op het gebied van infectieziekten en immuno-oncologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van antigeenspecifieke T-celresponsen in niet-menselijke primaatmodellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door geheugen- en activatiestatus te onderscheiden via oppervlakte- en intracellulaire markers.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door SIV-specifieke CD8+ T-cel-subsets te kwantificeren.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor de selectie en prioritering van immunologische targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde flowcytometrie-assays vast voor reproduceerbare detectie van antigeenspecifieke T-cellen.
- Standaardiseert gating-strategieën en markerpanels voor analyse van geheugen-T-cel-subsets.
- Maakt kwantitatieve, gemultiplexte read-outs mogelijk voor downstream screening van verbindingen of vaccins.
- Biedt schaalbare protocollen die aanpasbaar zijn aan andere antigensystemen en ziektemodellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt immuunmonitoring-eindpunten af tussen niet-menselijke primaatmodellen en translationele studies bij mensen.
- Ondersteunt biomarker-gestuurde evaluatie van de effectiviteit van vaccins of therapeutica in preklinische settings.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve immuuncorrelaten.
- Faciliteert continuïteit van discovery tot preklinische validatie voor immuun-gerichte assets.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op tetrameren gebaseerde flowcytometrie-methode is geïntegreerd in het continuüm van discovery naar preklinisch onderzoek, waardoor vroege validatie van immuuntargets wordt verbonden met de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Discovery Biology: Biedt robuuste instrumenten voor hypothesetoetsing en mechanistische verduidelijking van T-cel-gemedieerde immuniteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor het profileren van immuuncellen en de gereedheid van assays.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking mogelijk van de frequenties van memory T-cel subsets en activatiemarkers over verschillende experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de afstemming van immuunmonitoringsstrategieën tussen diermodellen en klinische studies.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor antigeenspecifieke T-celanalyse binnen diverse onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van immuuntargets en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Bevordert assay-standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor workflows voor immuunmonitoring.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie op het gebied van immunologie mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van immunologische activa.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en immunofenotypering.
- Vereist toegang tot high-parameter flowcytometers en gevalideerde antilichaampanels.
- Maakt strikte standaardisatie van gating- en kleuringsprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan verschillende antigensystemen, maar afhankelijk van de beschikbaarheid van specifieke pMHC-tetrameren.
- Potentiële beperkingen omvatten achtergrondkleuring en de noodzaak voor een zorgvuldige selectie van controles.
Veelgestelde vragen over biopharma
In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026