An Immunohistochemistry Staining for the Detection of Rabies Virus Antigens
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:34 min • July 8th, 2025
Begin with a slide carrying a formalin-fixed, paraffin-embedded rabies virus-infected mouse brain tissue section. The fixed section retains viral antigens via protein cross-linking.
Treat the slide with a xylene solution to remove the paraffin.
Immerse the slide in decreasing ethanol concentrations to rehydrate the tissue, making it compatible with aqueous solutions.
Introduce a protease-containing buffer to disrupt protein cross-links, improving antigen accessibility.
Submerge in hydrogen peroxide to block endogenous peroxidases, and apply a blocking solution to prevent non-specific interactions.
Introduce primary antibodies specific to the rabies antigen, forming antigen-antibody complexes.
Add biotinylated secondary antibodies, which bind to the primary antibodies. Incubate with streptavidin-conjugated peroxidase enzymes, which interact with biotin.
Introduce a peroxidase substrate, producing a magenta-red precipitate.
Counterstain the tissue with a nuclear stain, followed by a bluing agent, staining the nuclei blue.
The immunohistochemistry image reveals magenta-red spots in the cytoplasm, confirming the presence of rabies antigens in the tissue section.
Using a microtome, make a 5-micrometer paraffin section. Float the section on a water bath at 38 degrees Celsius, and collect it onto glass slides. Label the slides with a reagent-resistant pen. Place the slides onto a tray, and melt in an oven at 55 to 60 degrees Celsius for one hour.
Then, remove the slides from the oven, and immediately deparaffinize them using three consecutive xylene rinses of five minutes each. After this, rehydrate the sections on the slide by sequential immersions in decreasing dilutions of ethanol to deionized water, as outlined in the text protocol.
Treat the slides with the protease for 30 minutes for proteolytic antigen retrieval, then, rinse the slides in PBST for 10 minutes, and treat them with 3% hydrogen peroxide for 10 minutes. After this, wash the slides again with PBST for 10 minutes.
To begin, remove one slide from the buffer, making sure to only handle one slide at a time, while the others remain submerged, and use a paper towel to blot off excess buffer from around the tissue section. Place the slides into a humidity chamber, and incubate with normal goat serum at room temperature for 15 minutes.
Next, incubate the slides in the humidity chamber with the optimal predetermined dilution primary anti-rabies antibody and negative control antibodies at room temperature for 60 minutes with no washes in between. After this, wash the slides with PBST for 10 minutes, and incubate in a humidity chamber with the biotinylated antibody at room temperature for 15 minutes.
Wash the slides again with PBST for 10 minutes. Incubate the slides in a humidity chamber with streptavidin-HRP complex at room temperature for 15 minutes, and wash the PBST for 10 minutes. Then, incubate with AEC in a humidity chamber at room temperature for 10 minutes. Wash the slides in deionized water for 10 minutes and counterstain with Gill's hematoxylin diluted 1 to 2 with deionized water for two minutes.
After this, rinse off the excess hematoxylin by dip-rinsing the slides in deionized water. Rinse the slides in Scott's tap water for 30 seconds, and wash in deionized water for 10 minutes. Remove the slides one at a time and mount them with water-soluble mounting medium. Then, use a light microscope to read the slides.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor immunohistochemie om rabiesvirusantigenen aan te tonen in gefixeerd hersenweefsel van muizen. De methode omvat verschillende stappen, waaronder deparaffinering, rehydratatie en incubatie met antilichamen om de aanwezigheid van het virus te visualiseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Pathologie
Achtergrond
- Het hondsdolvirussen is een neurotropisch virus dat het centrale zenuwstelsel aantast.
- Immunohistochemie is een waardevolle techniek voor het detecteren van virale antigenen in weefselmonsters.
- Een juiste preparatie van weefselcoupes is cruciaal voor een succesvolle antigeenretrieval.
- Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor een effectieve visualisatie van rabies-antigenen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het detecteren van het rabiësvirus in hersenweefsel van muizen.
- Om het begrip van de pathogenese van rabiës te verbeteren door visuele bevestiging van de aanwezigheid van het virus.
- Om een betrouwbare immunohistochemische techniek vast te stellen voor toekomstige studies.
Gebruikte methoden
- Bereiding van in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselcoupes.
- Deparaffinering met xyleen en rehydratie via ethanol.
- Toepassing van protease voor antigeenherstel en blokkeringsoplossingen om aspecifieke binding te verminderen.
- Incubatie met primaire en secundaire antilichamen, gevolgd door visualisatie met een peroxidasesubstraat.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van rabiësantigenen als magenta-rode vlekken in het cytoplasma van geïnfecteerde neuronen.
- Bevestiging van de aanwezigheid van het rabiësvirus in de hersenweefselcoupes.
- Aantonen van effectieve antigeenherstelling en antilichaambinding via het beschreven protocol.
- Vestiging van een reproduceerbare methode voor toekomstig onderzoek naar de detectie van het rabiësvirus.
Conclusies
- Het immunohistochemieprotocol detecteert effectief rabiesvirusantigenen in gefixeerd muizenbreinweefsel.
- Deze methode kan worden gebruikt voor verdere studies naar de pathogenese van rabiës en de immuunrespons.
- Toekomstige toepassingen kunnen vergelijkende studies met andere neurotrope virussen omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Immunohistochemie maakt directe visualisatie van virale antigenen in gefixeerd weefsel mogelijk, wat targetvalidatie bij de ontdekking van antivirale middelen ondersteunt. Deze methode biedt ruimtelijke bevestiging van de aanwezigheid van pathogenen, wat helpt bij het mechanistisch verminderen van risico's in preklinische modellen. Het verhoogt het voorspellende vertrouwen door moleculaire detectie te koppelen aan de histopathologische context in onderzoek naar neurotrope virussen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt de binding aan het doelwit door rabiesantigeen te detecteren in geïnfecteerde weefselcoupes.
- Operationele waarde: Maakt ruimtelijke resolutie van de virale distributie in hersenweefsel mogelijk voor hypothesetoetsing.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de bevestiging van het doelwit via co-lokalisatie met neuronale markers.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert een kwantificeerbaar chromogeen signaal (magenta-rood precipitaat) voor antigeendetectie.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde stappen, inclusief protease-terugwinning en blokkering, zorgen voor een consistente toegankelijkheid van antigenen.
- Aanpasbaarheid van het platform: Compatibel met biotin-streptavidine-amplificatie voor het afstellen van de sensitiviteit in screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektemodel: Maakt gebruik van met formaline gefixeerd muizenbreinweefsel om de klinische pathogenese weer te geven.
- Translationele continuïteit: Maakt de overgang mogelijk van infectiemodel naar antigeenvalidatie in preklinische studies.
- Risicobeperking: Vermindert fout-negatieve resultaten via antigeen-retrieval en het blokkeren van endogeen peroxidase.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen de overgang van vroege ontdekking naar preklinisch onderzoek en biedt histopathologische bevestiging na in vivo infectiemodellen.
- Discovery Biology: Valideert de virale aanwezigheid in weefsel ter ondersteuning van de doelhypothese bij antivirale screening.
- Screening: Genereert een chromogene output die compatibel is met brightfield-microscopie voor kwalitatieve beoordeling.
- Analytics: Maakt semi-kwantitatieve evaluatie van de antigeenlast mogelijk via de intensiteit en distributie van het precipitaat.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vivo-modellen en doelbevestiging via weefselgebaseerde antigeendetectie.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan andere lyssavirussen of neurotrope pathogenen via antilichaamsubstitutie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Directe visualisatie van antigenen vermindert mechanistische ambiguïteit bij studies naar virale pathogenese.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde deparaffinatie en rehydratatie garanderen consistentie tussen de verschillende coupes.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie in de weefselcontext te bevestigen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogestuurde prioritering van antivirale kandidaten op basis van targetvalidatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologische en immunohistochemische technieken.
- Afhankelijk van de infrastructuur voor microtomen, ovens, bevochtigingskamers en lichtmicroscopen.
- Vereist standaardisatie van antilichamenverdunning en incubatietijden tussen gebruikers.
- Aanpassing aan nieuwe modellen vereist validatie van de efficiëntie van antigeenherstel.
- Beperkt door de kwaliteit van de weefselfixatie en het behoud van antigenen in paraffine-ingebedde coupes.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detection of Viral Proteins in Rabies Virus-Infected Mouse Brain Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026