An ATP Utilization Assay for Determining Bacterial Survival Under Antibiotics Treatment
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:56 min • July 8th, 2025
Begin by seeding a bacterial culture into an assay plate. Then, incubate the plate.
The bacterial cells have surface adhesins and pili that enable them to adhere to each other, forming small aggregates.
Add varying antibiotic concentrations to the wells, leaving one untreated for a control.
The antibiotic molecules interact with sensitive bacteria, affecting their ability to grow and reproduce, leading to their death.
The antibiotic-resistant bacteria remain metabolically active, producing ATP molecules.
Use a sonicator to disrupt the bacterial cells, releasing their intracellular contents, including ATP.
Add ATP-utilization glow reagent containing luciferin, luciferase enzyme, and other co-factors.
Luciferase utilizes ATP and oxygen to convert luciferin to an excited oxyluciferin.
The oxyluciferin subsequently transitions to its ground state, emitting luminescent light.
Measure the absorbance using a plate reader.
The decrease in absorbance at higher antibiotic concentrations suggests lower ATP production, indicating a reduced bacterial survival rate.
Measure the optical density at 650 nanometers or OD650 to determine the concentration of the suspended bacteria, and adjust the GC concentration to about 1 x 108 colony-forming units per milliliter. Next, add 99 microliters of the GC suspension into individual wells of a 96-well plate, and allow the bacteria to aggregate at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide for 6 hours.
At the end of the incubation, add 1 microliter of serially diluted ceftriaxone to each well, leaving some wells untreated to serve as controls, and return the plate to the incubator for another 24 hours. The next day, sonicate the suspension in each well three times at 144 watts and 20 kilohertz for 5 seconds per sonication, and add 100 microliters of commercially available ATP utilization glow reagent to each well.
Carefully transfer 150 microliters of mixture from each well into individual wells of a new 96-well black microplate and measure the absorbance of each well at 560 nanometers on a plate reader. Then, calculate the survival rate by the ratio of the reading obtained after serial antibiotic treatment to the reading from the untreated wells.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van variërende antibioticaconcentraties op de overlevingspercentages van bacteriën met behulp van luminescente ATP-detectie. De methodologie omvat het enten van bacterieculturen, het incuberen daarvan en het meten van de ATP-productie om de impact van antibiotica te beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Antibioticaresistentie
- Cellulair metabolisme
Achtergrond
- Bacteriële cellen kunnen aggregaten vormen via oppervlakte-adhesines en pili.
- Antibiotica interageren met gevoelige bacteriën, wat hun groei en reproductie beïnvloedt.
- ATP-productie is een belangrijke indicator van de bacteriële metabole activiteit.
- Luciferase-gebaseerde assays kunnen ATP-niveaus meten via luminescentie.
Doel van de studie
- Om de overlevingstesten van bacteriën onder verschillende antibioticabehandelingen te evalueren.
- Om ATP-detectie te gebruiken als maatstaf voor de bacteriële levensvatbaarheid.
- Om de relatie tussen de antibioticaconcentratie en de bacteriële metabole activiteit te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Het uitplaten van bacteriële culturen in assayplaten en het incuberen hiervan.
- Het toevoegen van verschillende concentraties antibiotica en het meten van de ATP-niveaus.
- Het gebruik van een sonicator om bacteriële cellen te lyseren en ATP vrij te maken.
- Het gebruik van luciferine en luciferase voor luminescente ATP-detectie.
Belangrijkste resultaten
- Hogere antibioticaconcentraties leidden tot een afname van de ATP-productie.
- Lagere absorbentiewaarden correleerden met verminderde overlevingspercentages van bacteriën.
- Metingen van de optische dichtheid bevestigden de aanpassingen van de bacteriële concentratie.
- Controleputjes vertoonden hogere ATP-niveaus in vergelijking met de behandelde putjes.
Conclusies
- Antibioticabehandeling heeft een aanzienlijke impact op de levensvatbaarheid van bacteriën.
- ATP-detectie is een effectieve methode om het overleven van bacteriën te beoordelen.
- Inzicht in deze interacties kan bijdragen aan onderzoek naar antibioticaresistentie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze op ATP gebaseerde assay biedt een kwantitatieve, luminescentie-gestuurde readout voor bacteriële overleving onder antibiotische druk, wat vroege validatie van targets mogelijk maakt bij de ontdekking van antimicrobiële middelen. Door metabole activiteit te koppelen aan de effectiviteit van verbindingen, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie en het voorspellende vertrouwen bij campagnes voor de identificatie van lead-verbindingen. De methode is direct toepasbaar op screeningscampagnes gericht op bacteriële pathogenen waarbij overleving correleert met het therapeutische doel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet bacteriële overleving als functionele read-out van target-engagement en pathway-inhibitie.
- Operationele waarde: Maakt snelle, kwantitatieve beoordeling van de effecten van verbindingen op microbiële levensvatbaarheid mogelijk.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetests en target-de-risking door antibioticumblootstelling te correleren met metabole output.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert dosis-responsgegevens op basis van de reductie van het ATP-signaal om de potentie van antibiotica te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde lysis en reagentia-toevoeging voor reproduceerbare, plaatgebaseerde luminescentiedetectie.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare screening van verbindingen mogelijk met een homogene readout zonder wastappen, die compatibel is met automatisering.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van antimicrobiële activiteit in klinisch relevante pathogenen zoals Neisseria gonorrhoeae.
- Operationele waarde: Levert continue, kwantitatieve overlevingsmetrieken die in vitro bevindingen verbinden met preklinische besluitvorming.
- Strategische waarde: Ondersteunt de optimalisatie van lead-verbindingen door het identificeren van verbindingen met een aanhoudende onderdrukking van de bacteriële metabole activiteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van antimicrobiële ontdekking, van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij overlevingmetrieken de prioritering van verbindingen informeren voorafgaand aan preklinische efficiëntiestudies.
- Discovery Biology: Test therapeutische hypothesen door ATP-depletie te meten als proxy voor bacteriële sterfte na blootstelling aan antibiotica.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve luminescentie-outputs die een rangschikking van de potentie van verbindingen over verschillende concentraties mogelijk maken.
- Analytics: Genereert berekeningen van de overlevingsratio via de verhouding tussen behandelsignalen en controlesignalen, ter ondersteuning van IC50-bepaling en modellering van de structuur-activiteitsrelatie.
- Translationeel Onderzoek: Gebruikt Neisseria gonorrhoeae-aggregaten als een klinisch relevant model om het gedrag van pathogenen in infectieniches te weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, reagensgestuurd platform dat toepasbaar is over verschillende bacteriële soorten en antibioticaklassen voor screening van de gehele portfolio.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door de behandeling met verbindingen te koppelen aan het meetbare verlies van microbiële metabole activiteit.
- Operationele waarde: Waarborgt de robuustheid van de assay door gestandaardiseerde cellyse en reagenskinetiek, waardoor variabiliteit tussen runs wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege go/no-go beslissingen mogelijk te maken op basis van overlevingskinetiek in plaats van endpoint CFU-tellingen.
- Impact op de portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van antimicrobiële leads via gestandaardiseerde, kwantitatieve overlevingsprofilering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van microbiologische culturen en het omgaan met pathogenen onder biosafety-omstandigheden.
- Afhankelijk van toegang tot een luminometer of platenlezer die in staat is tot absorptie- of fluorescentiedetectie bij 560 nm.
- Vereist standaardisatie van de bacteriële aggregatie en incubatietijd om een consistente ATP-opbrengst tussen de wells te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van sonicatieparameters om volledige lyse te bereiken zonder de assay-reagentia af te breken.
- Beperkt tot metabolisch actieve bacteriën; maakt mogelijk geen onderscheid tussen levensvatbare maar niet-kweekbare stadia en werkelijke celdood.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk
Gerelateerde video's
0 Bekeken
High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Lysostaphin-Based Enzyme Protection Assay: An In Vitro Method to Quantify Intracellular Staphylococcus aureus Load by Enzyme-Mediated Selective Killing of Extracellular Bacteria
Gerelateerde video's
0 Bekeken
ATP-Based Luciferase Viability Assay: A Homogenous Method to Evaluate the Growth-Inhibitory Potential of Test Agents on Tumor Organoids
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Assay to Measure the Accumulation of a Fluorescent Antibiotic Probe in Bacterial Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026