An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:46 min • July 8th, 2025
Take a multi-well plate with adherent mesenchymal stem cell, or MSC, culture.
Add peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, and incubate.
MSCs secrete hepatocyte growth factor, inducing monocytes to acquire an immunomodulatory phenotype, producing interleukin-10, or IL-10.
Transfer the PBMC-containing supernatant to a tube.
Add antibody-coated magnetic beads binding to monocyte surface marker CD14.
Use a magnetic separator to isolate the CD14+ monocytes, and add them to multi-well plate wells in increasing concentrations.
Introduce fluorescent dye CFSE-labeled effector CD4+ T cells.
Add antibody-conjugated microbeads binding specifically to T cell surface markers CD3 and CD28, activating the cells.
In the control well-lacking monocytes, activated T cells proliferate, with each cell division decreasing CFSE fluorescence intensity in daughter cells.
However, in co-cultures, MSC-induced monocytes secrete IL-10, suppressing effector T cell proliferation.
Using flow cytometry, observe fewer T cells exhibiting reduced CFSE fluorescence intensities with increasing monocyte concentrations, indicating the suppression of effector T cell proliferation by MSC-induced monocytes.
To perform an effector suppression assay, begin by setting up an MSC-PBMC co-culture with 2.5 x 106 PBMCs, co-cultured with 250,000 MSCs to ensure enough MSC co-cultured PBMCs for subpopulation selection.
After 48 to 72 hours at 37 degrees Celsius, select the MSC-induced immunomodulatory leukocytes of interest with the appropriate magnetic beads. Then, add CFSE-labeled allogeneic CD4-positive T cells in 1 milliliter of complete leukocyte medium per well, at various experimental ratios.
Next, add anti-CD3/28-conjugated microbeads at a 1-to-1 bead-to-cell ratio to stimulate the CD4-positive T cells. On the third day of co-culture, assess the proliferation of the CFSE-labeled CD4-positive T cells by flow cytometry.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de immunomodulerende effecten van mesenchymale stamcellen (MSCs) op mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs). Er wordt belicht hoe MSCs een immunosuppressief fenotype in monocyten induceren, wat leidt tot een verminderde proliferatie van T-cellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Stamcelbiologie
- Cellulaire interacties
Achtergrond
- Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben therapeutisch potentieel vanwege hun immunomodulerende eigenschappen.
- Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC's) zijn sleutelspelers in de immuunrespons.
- Inzicht in de interactie tussen MSC's en PBMC's kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- Interleukine-10 (IL-10) is een cytokine die betrokken is bij de immuunregulatie.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe MSC's het gedrag van PBMC's beïnvloeden.
- Om de rol van MSC-geïnduceerde monocyten bij de proliferatie van T-cellen te beoordelen.
- Om het potentieel van MSC's in immunotherapie te evalueren.
Gebruikte methoden
- Co-cultuur van MSC's met PBMC's om monocytenactivatie te induceren.
- Isolatie van CD14+ monocyten met behulp van magnetische beads.
- Flowcytometrie om T-celproliferatie te analyseren.
- Gebruik van CFSE-labeling om T-celdeling te volgen.
Belangrijkste resultaten
- MSC's induceren monocyten tot de secretie van IL-10, wat de proliferatie van T-cellen onderdrukt.
- Flowcytometrie toonde minder geactiveerde T-cellen aan in co-culturen met MSC-geïnduceerde monocyten.
- Verhoogde concentraties monocyten correleerden met een verminderde proliferatie van T-cellen.
- De studie bevestigt de immunosuppressieve rol van MSC-geïnduceerde monocyten.
Conclusies
- MSC's moduleren effectief immuunresponsen via monocytenactivatie.
- De secretie van IL-10 door monocyten speelt een cruciale rol bij de suppressie van T-cellen.
- Dit onderzoek ondersteunt het potentiële gebruik van MSC's in therapeutische toepassingen voor immuun-gerelateerde aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze assay maakt mechanistische risicoreductie van immunomodulerende therapieën op basis van MSC's mogelijk door de monocyten-gemedieerde suppressie van T-celproliferatie te kwantificeren. Het biedt een kwantitatieve uitlezing van IL-10-afhankelijke immunosuppressieve activiteit, wat targetvalidatie en lead-identificatie bij de ontwikkeling van immunotherapie ondersteunt. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door het door MSC's geïnduceerde monocytenfenotype te koppelen aan functionele immuunmodulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat MSC's immunomodulerende effecten uitoefenen via monocyteninductie en IL-10-secretie.
- Operationele waarde: Maakt isolatie en titratie van CD14+ monocyten mogelijk om dosis-responsrelaties bij immunosuppressie vast te stellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in het target door de monocytenconcentratie te correleren met de onderdrukking van de proliferatie van effector T-cellen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare co-cultuurcondities voor het beoordelen van de door MSC-geïnduceerde immunomodulerende functie van monocyten.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van CFSE-verdunning en flowcytometrie om een kwantitatieve resolutie op single-cell niveau van de remming van T-celproliferatie te leveren.
- Platformnut: Vestigt een schaalbaar immunoassay-formaat voor het evalueren van de immunomodulerende potentie van celtherapieën of biologische geneesmiddelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen het werkingsmechanisme van MSC's en preklinische effectiviteit door monocyt-afhankelijke immunosuppressie te modelleren in een menselijk relevant systeem.
- Predictieve risicoreductie: Maakt een vroege beoordeling van de immunomodulerende potentie mogelijk, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van celtherapie.
- Afstemming van biomarkers: Koppelt IL-10-secretie als functionele readout aan het werkingsmechanisme, ter ondersteuning van de translationele biomarkerstrategie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor de evaluatie van immunomodulerende activiteit mogelijk wordt na targetidentificatie en vóór lead-optimalisatie in celtherapie-pipelines.
- Discovery Biology: Valideert het door MSC's geïnduceerde immunomodulerende fenotype van monocyten via functionele suppressie van T-celproliferatie.
- Screening: Levert kwantitatieve, dosisafhankelijke resultaten van immunosuppressie voor de hit-to-lead progressie bij screening voor immunotherapie.
- Analytics: Maakt gebruik van flowcytometrie en CFSE-labeling om het delingsafhankelijke fluorescentieverlies te meten, waardoor statistische vergelijking van suppressie onder verschillende condities mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Modelleert menselijke immuunmodulatie met behulp van uit PBMC's afgeleide monocyten en allogene T-cellen, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een modulair, aanpasbaar platform voor het beoordelen van de immunomodulerende effecten van MSC's, engineered cells of immunomodulerende verbindingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van MSC-therapieën door de bevestiging van IL-10-gemedieerde immunosuppressie als functionele output.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde isolatie van CD14+ monocyten en CFSE-gebaseerde proliferatietracking waarborgen de reproduceerbaarheid van de assay op verschillende locaties.
- Strategische waarde: Maakt datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door de immunosuppressieve potentie vroeg in het ontwikkelingsproces te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van MSC-kandidaten op basis van een gevalideerd immunomodulerend mechanisme.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in primaire immuunceltuctuur, flowcytometrie en celseparatie op basis van magnetische beads.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers die in staat zijn tot multicolor-detectie en CFSE-signaalresolutie.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de timing van MSC-PBMC-cocultuur en monocytenisolatie om consistentie te waarborgen.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen kan validatie van de induceerbaarheid van monocyten en het immunosuppressieve fenotype vereisen.
- De sensitiviteit van de assay is afhankelijk van de zuiverheid van de monocyten en de efficiëntie van T-celactivatie, welke gecontroleerd moeten worden voor nauwkeurige resultaten.
Veelgestelde vragen over biopharma
Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Vaccine-Pulsed Dendritic Cell-Based In Vitro Assay to Induce Lymphocyte Proliferation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026