Real-Time Analysis of Resident T-cell Migration in Different Tumor Regions Using Confocal Microscopy
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:23 min • July 8th, 2025
Begin with a lung tumor slice containing resident T cells.
T cells migrate through the tumor microenvironment and interact with tumor cells and stromal elements, performing immune functions.
The composition of the tumor microenvironment strongly influences T cell displacement and velocity.
Add distinct fluorescently-coupled antibodies to label T cells, tumor cells, and stromal elements in the microenvironment.
Add DAPI, which infiltrates cells with a damaged plasma membrane to stain the nucleus, enabling the visualization of necrotic regions within the tumor.
Observe the stained sample under a confocal microscope.
Using a suitable fluorescence light, select a tumor region of interest containing resident T cells. Evaluate cell viability by assessing DAPI-positive cells.
For real-time analysis, define time intervals and total recording time.
To capture z-stack images, start at a depth below labeled T cells and capture images at various time intervals.
Utilize tracking software to compare the T cell displacement length and average velocity in different tumor regions.
Dilute the required fluorescently labeled antibodies and the fluorescence nuclear dye, DAPI, to the required final concentrations in phenol red-free RPMI medium. Next, remove the culture plate from the incubator and using a fine tip, aspirate out the liquid inside the stainless steel washers.
Now, without touching the slice, add 40 microliters of the diluted antibodies onto each tumor slice. To allow for staining, incubate the plate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. After the staining step is complete, using fine forceps, remove the washers. Then, gently take out the slices and dip them in phenol red-free RPMI1640 medium for 10 seconds. Place the slices back onto the cell culture inserts and add a drop of phenol red-free RPMI1640 medium over each slice. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 10 minutes and then proceed to imaging.
Several hours prior to starting this experiment, set the temperature of the microscope heat chamber to 37 degrees Celsius, then, prepare the microscope set up to constantly perfuse tumor slices with oxygenated phenol red-free RPMI medium, and to aspirate the solution to a waste collection flask using a peristaltic pump.
With the help of fine forceps, lift the stained slice out of the six-well plate, and transfer it to a 35-millimeter plastic dish filled with phenol red-free RPMI medium, then, place a slice anchor over the slice to support it. Next, place this Petri dish on the imaging stage of the microscope.
After connecting the inlet and outlet tips of the perfusion system, turn on the peristaltic pump to allow the oxygenated medium to go through the perfusion tubes. Lower the water immersion objective to the slice, and focus on the top of the slice with bright-field light or with the appropriate wavelength.
Then, using appropriate filters, visualize and select a region of interest that contains all the fluorescently labeled cells of interest namely the CD8 T cells, the tumor islets, and the CD90-positive stromal cells. Set up an imaging session using appropriate laser intensity and exposure times to suit the brightness of the fluorescent signals observed. Then, set up the Z-stack thickness to image within the tumor slice.
Next, select the Z-stack image time interval and the total recording time to capture images at specific time intervals. After capturing and exporting the fluorescent images, analyze CD8 T cell migration as described in the text protocol.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de dynamiek van T-celmigratie binnen longtumorslices, met een focus op hun interacties met tumorcellen en de omgevende micro-omgeving. De methodologie omvat fluorescentielabeling en confocale microscopie om het gedrag van T-cellen in real-time te visualiseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- T-cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons tegen tumoren.
- De tumormicro-omgeving beïnvloedt het gedrag van T-cellen aanzienlijk.
- Inzicht in de dynamiek van T-cellen kan bijdragen aan strategieën voor kankerimmunotherapie.
- Fluorescente labeling maakt gedetailleerde observatie van cellulaire interacties mogelijk.
Doel van de studie
- Om migratiepatronen van T-cellen binnen longtumoren te analyseren.
- Om de impact van de tumoromgeving op de verplaatsing en snelheid van T-cellen te beoordelen.
- Om geavanceerde imagingtechnieken te gebruiken voor real-time observatie.
Gebruikte methoden
- Bereiding van longtumorsnijplaten met aanwezige T-cellen.
- Fluorescente labeling van T-cellen, tumorcellen en stromale elementen.
- Confocale microscopie voor beeldvorming en analyse van celdynamiek.
- Tracking-software om de verplaatsing en snelheid van T-cellen te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Real-time imaging onthulde duidelijke migratiepatronen van T-cellen.
- De tumoromgeving beïnvloedde de snelheid en verplaatsing van T-cellen.
- Fluorescentielabeling highlightte effectief necrotische regio's en cellulaire interacties.
- Data-analyse leverde inzichten op in het gedrag van T-cellen in verschillende tumorregio's.
Conclusies
- De studie vergroot het inzicht in de dynamiek van T-cellen in longtumoren.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van gerichte immunotherapieën.
- Real-time imagingtechnieken zijn waardevol voor het bestuderen van immuunresponsen in tumoren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Real-time confocale beeldvorming van de migratie van residente CD8 T-cellen in menselijke longtumorsnijden biedt bruikbare inzichten in de dynamiek van immuuncellen binnen de tumormicro-omgeving. Deze mogelijkheid maakt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie mogelijk voor immuno-oncologieprogramma's, wat bijdraagt aan voorspellend vertrouwen op het snijvlak van discovery en translationeel onderzoek. Kwantitatieve migratiemetrieken informeren portfoliobeslissingen door de immuunbetrokkenheid en micro-omgevingsbarrières te verduidelijken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van T-cel-tumor- en T-cel-stroma-interacties in situ mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het kwantificeren van de verplaatsing en snelheid van immuuncellen.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor immunomodulerende targets binnen complexe weefselcontexten.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen in hypothesen over immuunactivatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde ex vivo tumorsnijsystemen vast voor daaropvolgende migratie-assays van immuuncellen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van de T-celmotiliteit over verschillende tumorregio's.
- Maakt standaardisatie van imaging- en analyseworkflows voor het tracken van immuuncellen mogelijk.
- Ondersteunt het screenen van verbindingen of biologische geneesmiddelen die de migratie van immuuncellen moduleren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt metrieken voor migratie van immuuncellen af met ziekterelevante menselijke tumormicro-omgevingen.
- Slaat een brug tussen ontdekkingsresultaten en preklinische validatie door weefselarchitectuur en heterogeniteit te behouden.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van immuno-oncologische middelen op basis van functionele immuunread-outs.
- Ondersteunt de translationele ontwikkeling van biomarkers voor infiltratie en activiteit van immuuncellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze workflow voor beeldvorming en analyse is geïntegreerd van vroege ontdekking tot translationeel onderzoek, waardoor iteratieve hypothesetoetsing en mechanistische risicoreductie in immuno-oncologiepijplijnen mogelijk worden.
- Discovery Biology: Kwantificeert de migratie van T-cellen en de interactie met tumor- en stromacompartimenten voor de verduidelijking van signaalpaden.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve migratie-assays voor modulatoren van immuuncellen.
- Analytics: Genereert metrieken voor verplaatsing en snelheid voor een robuuste statistische vergelijking tussen verschillende tumorregio's.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt de context van menselijk weefsel voor preklinische continuïteit en afstemming van biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar ex vivo platform voor studies naar immuuncelmigratie over meerdere programma's heen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij het targeten van immuuncellen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor imaging en analyse voor studies naar immuunmigratie.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie door de immuunbetrokkenheid in menselijk tumorweefsel te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immuno-oncologische activa op basis van functionele immuunmetrieken.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie en het behandelen van levend weefsel.
- Vereist toegang tot geavanceerde imagingplatforms en trackingsoftware.
- Noodzaak tot standaardisatie van kleurings-, imaging- en analyseprotocollen tussen teams.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende tumortypes of immuuncelpopulaties.
- Viabiliteit en weefselkwaliteit kunnen de reproduceerbaarheid en interpreteerbaarheid van de assay beperken.
Veelgestelde vragen over biopharma
Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging Tumor Cell Migration in Glioblastoma Tissue Using Time-Lapse Scanning Confocal Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026