Name: Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Leer biofysische testen om mechanische eigenschappen van de celkern te meten met behulp van substraatvervorming en micromaaldjesmanipulatie. Deze methoden onderzoeken krachtoverdracht tussen kern en cytoskelet in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 HL082792 en R01 NS059348) en het Brigham and Women&#39;s Hospital Cardiovascular Leadership Group Award.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Substraat stam assay Stam aanvraag is met succes gebruikt door ons en andere groepen om geïnduceerde nucleaire vervormingen in de cellen blootgesteld aan mechanische belasting te bestuderen en om de bijdrage van specifieke nucleaire envelop-eiwitten te onderzoeken nucleaire stijfheid. 4-8 Het voordeel van deze techniek is dat het sondes mechanische eigenschappen van het leven kernen in hun normale cellulaire en cytoskeletale milieu en dat de ondergrond stam applicatie lijkt op de fys...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Red FM en Groen FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425-en M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Gebufferde Salt Hank&#39;s Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Fenol gratis, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Borosilicaatglas met een gloeidraad </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Gloss / Gloss niet-versterkte siliconen bekleding, 0,005 &quot; </td><td> Specialty Manufacturing Inc </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 mm glazen bodem cultuur gerechten (FluoroDish) </td><td> Wereld precisie-instrumenten, INC </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 Vacuum Grease </td><td> Spi levert </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

biofysische testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern probe: basismateriaal strain toepassing en micronaaldjes manipulatie

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In de meeste eukaryotische cellen, de kern is de grootste organel en is meestal 2 tot 10 keer stijver dan de omringende cytoskelet, bijgevolg, de fysische eigenschappen van de kern belangrijke mate bijdragen aan de algehele biomechanische gedrag van cellen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Bijvoorbeeld bij het ​​migreren van neutrofielen en binnendringende kankercellen, de nucleaire stijfheid kan een groot obstakel vormen bij extravasatie of passage door smalle ruimtes binnen weefsels. 1 Aan de andere kant, de kern van cellen in mechanisch actief weefsel zoals spier vereist voldoende structurele steun aan bestand tegen herhaalde mechanische belasting. Belangrijk is dat de kern nauw geïntegreerd in de cellulaire architectuur, het is fysiek verbonden met de omliggende cytoskelet, dat is een kritische voorwaarde voor de intracellulaire beweging en positionering van de kern, bijvoorbeeld in gepolariseerde cellen, synaptische kernen op neuromusculaire verbindingen, of in migrerende cellen. 2 is niet verrassend, mutaties in de nucleaire enveloppe eiwitten zoals lamins en nesprins, die een kritische rol spelen bij het ​​bepalen van de nucleaire stijfheid en nucleo-cytoskeletale koppeling, zijn onlangs resulteerde in een aantal menselijke ziekten, waaronder Emery- Dreifuss spierdystrofie, limb-girdle spierdystrofie, en gedilateerde cardiomyopathie. 3 Om de biofysische functie van diverse nucleaire envelop eiwitten en het effect van specifieke mutaties te onderzoeken, hebben we experimentele methoden om de fysische eigenschappen van de kern studie in enkele, levende cellen onderworpen aan globale of lokale mechanische storing. Het meten van geïnduceerde nucleaire vervormingen in reactie op precies toegepast ondergrond stam toepassing levert belangrijke informatie over de vervormbaarheid van de kern en maakt kwantitatieve vergelijking tussen verschillende mutaties of cellijnen die deficiënt zijn voor specifieke nucleaire envelope eiwitten. Gelokaliseerde cytoskelet stam applicatie met een microneedle wordt gebruikt om deze test te vullen en kan aanvullende informatie opleveren over intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet. Studeren nucleaire mechanica in intacte levende cellen behoudt zich het normale intracellulaire architectuur en vermijdt mogelijke artefacten die kunnen ontstaan ​​bij het werken met geïsoleerde kernen. Bovendien ondergrond stam toepassing presenteert een goed model voor de fysiologische stress ervaren door cellen in de spieren of andere weefsels (bijvoorbeeld vasculaire gladde spiercellen blootgesteld aan schip-stam). Ten slotte, terwijl deze tools zijn primair ontwikkeld om nucleaire mechanische studie, kunnen ze ook worden toegepast op de functie van cytoskeleteiwitten en mechanotransductie signalering te onderzoeken.

We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

In de meeste eukaryote cellen is de nucleus het grootste organel en is deze doorgaans 2 tot 10 keer stijver dan het omringende cytoskelet; bijgevolg is de ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is het meten van de mechanische eigenschappen van de interface van de celkern en de fysieke verbinding hiervan met het omringende cytoskelet. Dit wordt bereikt door mechanische rek toe te passen op cellen die zijn geplaatst op een transparant siliconen membraan en door de opgewekte kernvervormingen in beeld te brengen. Toegenomen kernvervormingen komen overeen met een afgenomen stijfheid van de kern, aangezien veranderingen in de koppeling tussen de kern en het cytoskelet eveneens de opgewekte kernvervormingen kunnen beïnvloeden.Intracellulaire krachtoverdracht tussen het cytoskelet en de nucleus wordt direct onderzocht door gelokaliseerde rek toe te passen op het cytoskelet. De verplaatsing van fluorescentielabelde nucleus- en cytoskeletstructuren wordt vervolgens in beeld gebracht. De resultaten tonen de stijfheid van celkernen aan in verhouding tot het omringende cytoskelet.Op basis van de experimenten met substraatspanning onthult de micronaaldmanipulatie-assay dat verstoring van de koppeling tussen de celkern en het cytoskelet defecten veroorzaakt in de intracellulaire krachtoverdracht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek

biophysical-assays-to-probe-mechanical-properties-interphase-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Beschreven worden protocollen voor het kwantificeren van mechanische interacties tussen aderente cellen en microgestructureerde substraten. Deze interacties zijn nauw verbonden met essentiële celgedragingen, waaronder migratie, proliferatie, differentiatie en apoptose. De protocollen presenteren een open-source beeldanalysesoftware genaamd MechProfiler, die de bepaling van betrokken krachten voor elke micropost mogelijk maakt.

Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

We presenteren een methode van celinjectie via naaldvrije waterstraaltechnologie in combinatie met een vervolg op onderzoeken na toediening in termen van cellulaire levensvatbaarheid, proliferatie en elasticiteitsmetingen.

Injectie van van varkensweefsel afgeleide stromacellen via waterstraaltechnologie

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

De verkenning van cellulair gedrag onder mechanische stress is cruciaal voor vooruitgang in cellulaire mechanica en mechanobiologie. We introduceren de Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA)-techniek, een nieuwe methode die gecontroleerde mechanische stimulatie combineert met uitgebreide analyse van intracellulaire signalering in afzonderlijke cellen. Deze techniek onderzoekt nieuwe diepgaande studies van mechanobiologie van levende cellen.

Fluorescentie-micropipetaspiratietest om mechanosensing van rode bloedcellen te onderzoeken

Leer biofysische testen om mechanische eigenschappen van de celkern te meten met behulp van substraatvervorming en micromaaldjesmanipulatie. Deze methoden onderzoeken krachtoverdracht tussen kern en cytoskelet in levende cellen.

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie (Video) | JoVE Journal

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Meer video's verkennen