Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Het algemene doel van de volgende experimenten is het meten van de mechanische eigenschappen van de interface van de celkern en de fysieke verbinding hiervan met het omringende cytoskelet. Dit wordt bereikt door mechanische rek toe te passen op cellen die zijn uitgeplaat op een transparant siliconen membraan en door de geïnduceerde nucleaire deformaties in beeld te brengen. Toegenomen nucleaire deformaties komen overeen met een afgenomen stijfheid van de kern, aangezien veranderingen in de koppeling tussen kern en cytoskelet de geïnduceerde nucleaire deformatiesebenadering eveneens kunnen beïnvloeden.

Intracellulaire krachtoverdracht tussen het cytoskelet en de nucleus wordt direct onderzocht door gelokaliseerde rek aan te brengen op het cytoskelet. De verplaatsing van fluorescentielabelled NU nucleaire en cytoskeletale structuren wordt vervolgens in beeld gebracht. De resultaten tonen de stijfheid van celkernen aan in vergelijking met het omringende cytoskelet.

Op basis van de experimenten met substraatspanning onthult de micronaaldmanipulatie-assay dat verstoring van de koppeling tussen de kern en het cytoskelet leidt tot defecten in de intracellulaire krachtoverdracht. Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden, zoals micropipet-aspiratie van geïsoleerde kernen, is dat ze metingen van de kernmechanica in intacte levende cellen mogelijk maken zonder de normale cellulaire architectuur te verstoren. Deze methoden kunnen inzicht bieden in hoe veranderingen in de samenstelling van de kernenvelop de mechanische eigenschappen van de kern kunnen beïnvloeden.

Ze kunnen ook worden toegepast om de rol van nucleaire mechanica te bestuderen in de context van ziekten zoals LA-neuropathieën of kanker. Elke rekplaat bestaat uit een op maat gemaakte bodemloze plastic schaal met een diameter van drie inch en een plastic O-ring om een siliconen membraan vast te houden, dat dient als substraat voor de celkweek. Voor de bereiding van de rekplaat klemt u een stuk siliconen membraan van vier inch bij vier inch tussen een O-ring en de schaal, snijdt u voorzichtig het overtollige membraan weg, spoelt u de rekplaat met gedeïoniseerd water en autoclaveert u vervolgens de schaal voordat u het siliconen membraan coatet met extracellulaire matrixmoleculen; markeer een referentiepunt op de buitenkant van het membraan in het midden van de bodem.

Dit referentiepunt helpt bij het identificeren van dezelfde cellen tijdens de rekexperimenten voor de toepassing van uniaxiale rek. Twee parallelle stroken plakband worden rond het referentiepunt aangebracht om de vorming van het membraan in één dimensie te beperken. Voor een optimale celaanhechting worden de siliconen membranen gecoat met 3 µg/mL fibronectine of andere geschikte extracellulaire matrixeiwitten.

Dek de zeefschaal af met een omgekeerde polystyreen schaal van 10 centimeter en incubeer deze de volgende dag overnacht bij vier graden Celsius. Spoel het membraan eenmaal met PBS om overtollig eiwit te verwijderen. Vul de schaal met 10 milliliters groeimedium en zet deze apart.

Zodra de gecoate siliconen membraanschaal is voorbereid, worden de cellen gedisassocieerd met 0,05% trypsine en worden de adherente cellen in groeimedium op de schaal gezaaid. Deze procedure wordt gedemonstreerd met embryonale muiscellen.

Incubeer de fibroblasten of mesenchymale cellen gedurende 24 tot 48 uur onder normale kweekcondities. Een omgekeerde microscoop die is uitgerust voor substraatstretch-experimenten bevat een stretchapparaat bestaande uit een basisplaat die op de microscooptafel past. De plaat houdt een centraal cilindrisch platin vast, dat dient om rek aan te brengen op het centrale gedeelte van het siliconenmembraan.

Het apparaat beschikt ook over een beweegbare plaat die de rek-schaal vasthoudt en op vier geleidepinnen omhoog en omlaag kan schuiven, evenals een gewicht van vijf pond om een belasting aan te brengen. Om de kernen te visualiseren, worden de cellen in de rek-schaal 15 minuten lang bij 37 °C geïncubeerd met één µg/mL Hoechst-kleurstof. Na incubatie wordt het medium afgezogen en vervangen door 15 mL fenolroodvrij groeimedium met 25 mM HEPES.

Schroef vervolgens de schaal in de schaalhouder en breng voorzichtig vet aan op de rand van de onderkant van het siliconen membraan om te zorgen dat het membraan soepel over het centrale platina glijdt. Zorg ervoor dat het centrale gedeelte van het membraan schoon blijft. Plaats de basisplaat op de objecttafel van de microscoop en monteer de schaalhouder voorzichtig op de basisplaat.

Zorg ervoor dat het siliconen membraan van de rekschaal in de initiële rustpositie losjes op het centrale platje rust. Focus vervolgens op de onderkant van het siliconen membraan en zoek het centrale zwarte referentiepunt. Dit punt dient als startpunt voor alle beeldacquisities en helpt bij het lokaliseren van dezelfde cellen tijdens en na het rekken.

Op deze afbeelding vult de centrale stip het volledige gezichtsveld. Begin bij de rand van de stip en stel de focus zo in dat de cellen en de bovenzijde van het siliconenmembraan zichtbaar worden. Lokaliseer goed uitgespreide cellen met centraal gelegen kernen.

Maak een fasecontrastafbeelding waarbij de focus op de celomtrek en het siliconen membraan moet liggen. Maak vervolgens een fluorescentieafbeelding van de nu nucleaire hook-kleuring, waarbij de focus op het centrale vlak van de celkern moet liggen. Nadat afbeeldingen van vijf tot 15 cellen zijn gemaakt, keert u terug naar het centrale stipje.

Breng het gewicht langzaam aan op de rekplaat, zodat er een uniforme rek wordt toegepast in het centrum van de plaat. De maximale toegepaste substraatrek wordt beperkt door nylon afstandsstukken die op de verticale uitlijningspinnen zijn geplaatst. Focus na het aanbrengen van de rek op de onderkant van het siliconenmembraan en lokaliseer opnieuw het referentiepunt; begin vanaf dit punt.

Verplaats dezelfde cellen en neem opnieuw een fasecontrast- en fluorescentiebeeld op van elke celkern onder volledige rek, waarbij gepoogd wordt de brandpuntsvlakken van de initiële beelden nauwkeurig te benaderen. Dit proces mag niet langer dan 10 minuten duren om actieve remodellering en aanpassing van de cel aan het vreemde substraat te voorkomen. Nadat alle overeenkomstige beelden zijn verkregen, wordt de microscooptafel teruggebracht naar het startpunt.

Verwijder voorzichtig het gewicht van de houderplaat voor de schaal en laat het siliconen membraan indien nodig ontspannen. Duw de zeefschaal voorzichtig omhoog tot deze zich in de beginpositie bevindt. Neem vervolgens fasecontrast- en fluorescentiebeelden op.

Beelden van de cellen na de rek, zoals beschreven voor de beelden tijdens de rek, beelden van cellen en fluorescentie-gelabelde kernen vóór, tijdens en na de toepassing van de rek worden geanalyseerd om de genormaliseerde kernrek te berekenen. In deze demonstratie wordt een op maat geschreven MATLAB-script gebruikt voor de analyse, maar er zijn verschillende alternatieve opties beschikbaar om de toegepaste substraatrek handmatig te berekenen door de posities van drie tot zes controlepunten op het membraan tussen de corresponderende beelden vóór en na de rek te matchen. Het MATLAB-programma berekent vervolgens de toegepaste membraanrek door de posities van bij elkaar passende controlepunten tussen de beelden vóór de rek en tijdens de volledige rek te vergelijken.

Posities worden ook vergeleken voor de residuele rek tussen de beelden vóór en na de rek. De controlepunten worden gelijktijdig gebruikt om de beeldparen te registreren, wat helpt bij het detecteren van beschadigde of loslatende cellen. Selecteer vervolgens handmatig de kernen met behulp van een apart MATLAB-programma dat de kernrek voor elke individuele kern berekent.

Dit wordt bereikt door de kerngrootte te matchen tussen overeenkomstige fluorescentiebeelden vóór en na de rek, of door intranucleaire markers te matchen om rekening te houden met kleine variaties in de toegepaste membraanrek tussen verschillende experimenten. De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde kernrek. Dit is gedefinieerd als de verhouding tussen de geïnduceerde kernrek en de toegepaste membraanrek, berekend voor elke kern.

De MATLAB-scripts zijn op aanvraag verkrijgbaar bij het lambing-laboratorium. Als laatste stap wordt elke nucleus gevalideerd en worden metingen van cellen die loslaten of beschadigd raken tijdens de toepassing van de rek uitgesloten. MEF's die over twee verschillende gebieden op het siliconen membraan waren verspreid, werden gefotografeerd met fasecontrast- en fluorescentiemicroscopie vóór, tijdens en na de toepassing van 20% uniaxiale rek; hier wordt een voorbeeld getoond van een succesvol experiment met valide nuclei van cellen die de toepassing van de rek overleven zonder beschadiging of loslating.

Daarentegen werden de hier getoonde cellen ingetrokken of raakten ze gedeeltelijk los tijdens het aanbrengen van de rek en zijn ze uitgesloten van de analyse. De cel aan de linkerkant vertoont tekenen van cytoskeletschade en nucleaire collaps, terwijl de cel aan de rechterkant gedeeltelijk loslaat en intrekt tijdens het aanbrengen van de rek. Dit kan een indicatie zijn van overmatige rek.

Hier wordt een analyse getoond van de genormaliseerde nucleaire rek in een paneel van verschillende meth-cellijnen van Lamin AC-deficiënte muizen; de cellen brengen ectopisch ofwel een lege vector ofwel wild-type lamin A tot expressie in vergelijking met meth-cellen van wild-type nestgenoten. Verlies van expressie van de eiwitten van de kernenvelop Lamin AC resulteert in een verhoogde genormaliseerde nucleaire rek. Dit is indicatief voor een afgenomen nucleaire stijfheid, die gedeeltelijk of volledig kan worden hersteld door reintroductie van wild-type Lamin A. Om het experiment met micronaaldmanipulatie voor te bereiden, wordt een glazen kweekschaal van 35 millimeter met een lage concentratie fibronectine gedurende twee uur geïncubeerd bij 37 °C; na incubatie wordt de schaal tweemaal gewassen met HBSS en worden twee milliliters groeimedium aan de schaal toegevoegd.

Vervolgens worden muizembryonale fibroblasten getrypsiniseerd met 0,05% trypsine en in twee milliliter groeimedium gezaaid op de met fibronectine gecoate glazen bodemschaal. Om enkelvoudige, adherente, niet-confluente cellen te verkrijgen, worden de cellen een nacht teruggeplaatst in de incubator. Voeg voor het kleuren van de cellen MitoTracker mitochondriale kleurstof en Hoechst-kernkleurstof toe aan het groeimedium. Voeg dit groeimedium toe aan de cellen en laat deze vervolgens incuberen.

Was vervolgens de cellen door ze vijf minuten bij kamertemperatuur te incuberen in hank's gebufferde zoutoplossing. Voeg daarna groeimedium zonder fenolrood met 25 millimolair HEPES toe aan de cellen voor beeldvorming.

Plaats voor het micronaaldexperiment een eerder uitgetrokken micronaald in een micromanipulator die is gekoppeld aan een omgekeerde microscoop met een digitale charge-coupled device camera en focus de micronaald nabij een enkele cel. Leg één beeld van de enkele cel vast voordat de micronaald in het cytoskelet wordt ingebracht.

Maak in fasecontrast één fluorescentiebeeld van de hooks 3 3, 3 4 2 kleuring en één fluorescentiebeeld van de mitochondriale kleuring met een 60 x objectief op een omgekeerde microscoop. Gebruik de micromanipulator om de micronaald voorzichtig in het cytoplasma van een cel in te brengen op een vaste afstand van de nucleaire periferie en maak één fasecontrastbeeld, één fluorescentiebeeld van de hooks 3 3, 3 4, 2 kleuring en één fluorescentiebeeld van de mitochondriale kleuring. Verplaats de micronaald met een specifieke afstand naar de celperiferie met een snelheid van één micrometer per seconde met behulp van de computergestuurde micromanipulator, terwijl er elke 10 seconden automatisch beelden worden vastgelegd.

Terwijl de micronaald naar een specifieke afstand richting de celperiferie beweegt, moet de micromanipulator via een computer worden aangestuurd om een consistente micromanipulatie te bereiken. De procedures worden afgesloten met het maken van beelden nadat de micronaald is verwijderd; de beelden van de fluorescentielabelled kenmerken van de kern en het cytoskelet, verkregen vóór, tijdens en na de manipulatie met de micronaald, worden geanalyseerd om de verplaatsing van kleine intracellulaire regio's te berekenen. In deze demonstratie wordt een speciaal geschreven MATLAB-script gebruikt voor de analyse, maar er zijn verschillende andere opties beschikbaar.

Het MATLAB-script is op aanvraag verkrijgbaar bij het laboratorium van Lambing om de verplaatsing veroorzaakt door de micronaald te meten. Het MATLAB-programma maakt gebruik van een genormaliseerd cross-correlatie-algoritme om de verschuiving te berekenen tussen de oorspronkelijke locatie van de fluorescentie-gelabelde kenmerken en hun nieuw geïdentificeerde positie. De verplaatsingen worden vervolgens weergegeven als vectorkaarten en opgeslagen als numerieke waarden.

De volgende stap is om de resulterende verplaatsingsvectorkaarten te gebruiken om de gemiddelde verplaatsingen binnen het cytoskelet of de nucleus te bepalen met Matlab. Selecteer eerst drie of meer punten binnen het cytoskelet op de plaats waar de rek wordt toegepast. Neem in de verplaatsingsvectorkaart de gemiddelde numerieke waarde om de mate van cytoskeletrek nabij de applicatieplaats te bepalen die tijdens het aanbrengen van de micronaald is gegenereerd.

Select vervolgens drie of meer punten binnen de nucleus nabij de plek van rektoepassing en bereken de gemiddelde waarde. Deze waarde vertegenwoordigt de hoeveelheid nucleaire rek nabij de plek van toepassing van de micronaald. Bepaal met dezelfde methode de nucleaire rek en de rek van het cytoskelet buiten de plek van rektoepassing, op basis van punten die in deze respectievelijke regio's zijn geselecteerd.

Er werd een micronaald-manipulatie-assay uitgevoerd om de intracellulaire krachtoverdracht te meten. Hier worden fasecontrastbeelden en fluorescentiebeelden getoond van een fibroblast die is gelabeld met een blauwe kernkleuring en MIT tracker green mitochondriële kleuring. Een micronaald werd in het cytoskelet ingebracht op een gedefinieerde afstand van de kern en vervolgens in de richting van de celperiferie bewogen.

De mitochondriale verplaatsing werd gevolgd vóór, tijdens en na cytoskeletale rek, waarna de verplaatsingen als vectoren werden uitgezet. Elke vector vertegenwoordigt de verplaatsing, berekend als de verschuiving tussen de oorspronkelijke locatie en de nieuw geïdentificeerde positie. Regio's met een lage beeldintensiteit of onvoldoende textuur werden uitgesloten van de analyse.

De cytoskeletale en nucleaire verplaatsing werden vervolgens gekwantificeerd in geselecteerde gebieden op toenemende afstanden van de plek waar de rek werd toegepast, voor zowel de controlefibroblasten als de fibroblasten. Bij cellen met een intacte nucleo-cytoskeletale koppeling worden krachten door de hele cel getransmiteerd, wat resulteert in een geïnduceerde nucleaire en cytoskeletale deformatie die langzaam afneemt naarmate de afstand tot de plek van rektoepassing toeneemt. In contrast hiermee vertonen cellen met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling een gelokaliseerde verplaatsing nabij de toepassingsplaats en slechts een geringe geïnduceerde deformatie verder weg.

Vergelijkbare toepassing van cytoskeletale rek op de plaats van insertie van de micronaald wordt waargenomen bij zowel controle-fibroblasten als fibroblasten met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling. Echter, de geïnduceerde nucleaire en cytoskeletale verplaatsing in andere regio's was significant kleiner in de fibroblasten met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling dan in de controlecellen. Een afname van de cytoskeletale en nucleaire verplaatsing weg van de plek waar de rek wordt toegepast, wijst dus op een verstoring van de krachtoverdracht tussen het cytoskelet en de nucleus.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nucleaire mechanica en de intracellulaire krachtoverdracht tussen de kern en het cytoskelet kunt meten. U kunt deze technieken gebruiken om het effect van mutaties in eiwitten van de kernenvelop te bestuderen, of veranderingen in de samenstelling van de kernenvelop die optreden tijdens de ontwikkeling of bij kanker.