A Whole-Mount Organ Staining Technique for Three-Dimensional Imaging of the Kidney
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:43 min • July 8th, 2025
Loading...
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om de transparantie van gefixeerd nierweefsel van muizen te verhogen om de distributie van sympathische zenuwen te visualiseren met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. Het proces omvat delipidatie en ontkleuring met CUBIC-L, gevolgd door immunokleuring en refractie-indexmatching met CUBIC-R+.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Histologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Lichtverstrooiing en -absorptie in weefsel kunnen cellulaire structuren maskeren.
- CUBIC-L en CUBIC-R+ zijn chemische oplossingen die worden gebruikt om de weefseltransparantie te vergroten.
- Immunokleuring maakt de visualisatie van specifieke eiwitten in weefsels mogelijk.
- Light-sheet fluorescentiemicroscopie is een techniek voor het maken van driedimensionale beelden van biologische monsters.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het visualiseren van de distributie van sympathische zenuwen in nierweefsel.
- Het verbeteren van de weefseltransparantie voor betere beeldvormingsresultaten.
- Het aantonen van de effectiviteit van CUBIC-L en CUBIC-R+ bij de weefselpreparatie.
Gebruikte methoden
- Gefixeerd nierweefsel van muizen werd behandeld met CUBIC-L voor delipidatie en ontkleuring.
- Primaire antilichamen werden toegevoegd om zich te binden aan specifieke markers voor neuronale cellen en spiercellen.
- Secundaire antilichamen, gelabeld met fluorforen, werden gebruikt voor visualisatie.
- Light-sheet fluorescentiemicroscopie werd ingezet om driedimensionale beelden vast te leggen.
Belangrijkste resultaten
- Het proces van ontvetten en ontkleuren verhoogde de transparantie van het weefsel aanzienlijk.
- Succesvolle immunokleuring maakte een duidelijke visualisatie van sympathische zenuwen rond de nierslagaders mogelijk.
- Driedimensionale beeldvorming bood gedetailleerde inzichten in de zenuwdistributie.
- Het protocol demonstreerde reproduceerbaarheid en effectiviteit voor vergelijkbare studies.
Conclusies
- De combinatie van CUBIC-L en CUBIC-R+ is effectief voor het vergroten van de weefseltransparantie.
- Deze methode kan worden toegepast op andere weefsels voor een verbeterde beeldvorming van cellulaire structuren.
- Light-sheet fluorescentiemicroscopie is een krachtig instrument voor het bestuderen van complexe weefselarchitecturen.
Veelgestelde vragen
Wat is het belangrijkste voordeel van het gebruik van CUBIC-L?
CUBIC-L verwijdert effectief lipiden en pigmenten, waardoor de weefseltransparantie wordt vergroot voor een betere beeldvorming.
Hoe werkt light-sheet fluorescentiemicroscopie?
Het maakt gebruik van dunne lichtvlakken om monsters te verlichten, wat driedimensionale beeldvorming met een hoge resolutie mogelijk maakt.
Op welke typen weefsels kan deze methode worden toegepast?
Deze methode kan worden aangepast voor diverse weefsels, in het bijzonder weefsels die een verbeterde transparantie vereisen voor beeldvorming.
Wat zijn de belangrijkste stappen in het delipideringsproces?
De belangrijkste stappen omvatten immersie in CUBIC-L, voorzichtig schudden en herhaalde wasbeurten met PBS.
Waarom is het matchen van de brekingsindex belangrijk?
Het minimaliseert lichtverstrooiing, waardoor de kwaliteit van de beelden die tijdens de microscopie worden vastgelegd, wordt verbeterd.
Relevantie voor de industrie
Deze methode voor weefselverheldering en beeldvorming maakt hoogresolutie driedimensionale visualisatie van de sympathische innervatie en vasculaire architectuur in volledige organen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in targetvalidatiestudies. Door kwantitatieve ruimtelijke mapping van neurovasculaire interacties te bieden, vergroot de methode het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen van renale en cardiovasculaire aandoeningen. De reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van het protocol faciliteren crossfunctionele samenwerking tussen teams op het gebied van discovery biology, beeldvorming en translationele wetenschappen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het visualiseren van het patroon van sympathische zenuwen rond de nierarteriën in intact weefsel.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van target-engagement in neurovasculaire eenheden.
- Voorspellende waarde: Verbetert de triage van de portfolio door het blootleggen van off-target innervatie-effecten die beoordelingen van de geneesmiddelveiligheid kunnen beïnvloeden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, transparante nierpreparaten die geschikt zijn voor multiplexe immunostaining en geautomatiseerde imaging-workflows.
- Kwantitatieve output: Levert driedimensionale fluorescentie-uitlezingen die morfometrische analyse van zenuwdichtheid en vasculaire nabijheid mogelijk maken.
- Herbruikbaarheid van het platform: Vestigt een herbruikbare basis voor weefselklaring voor downstream screening van verbindingen die de renale innervatie of vasculaire tonus beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert sympathische overactiviteit bij hypertensie en diabetische nefropathie via ruimtelijke zenuw-arterie mapping.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery-imaging en preklinische validatie door de neurovasculaire architectuur te behouden voor longitudinale studies.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Ondersteunt go/no-go-criteria op basis van kwantificeerbare veranderingen in sympathische remodellering na interventie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor verbindingen die de activiteit van het autonome zenuwstelsel in de nier moduleren.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten van neurale mechanismen in de renale pathofysiologie via directe weefselvisualisatie.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door reproduceerbare clearing en kleuring, wat betrouwbare screeningcampagnes voor verbindingen ondersteunt.
- Analytics: Levert ruimtelijke fluorescentiemetingen en colocalisatiemetrieken die een objectieve vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft structurele continuïteit van discovery naar preklinisch onderzoek door de driedimensionale neurovasculaire context te behouden.
- Enterprise Hergebruik: Functioneert als een schaalbaar imagingplatform dat toepasbaar is op meerdere orgaansystemen en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurovasculaire targets te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria door gedefinieerde parameters voor het klaren en kleuren.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van off-target neurale effecten mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door target-gemedieerde veranderingen in renale innervatiepatronen te kwantificeren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunohistochemie, weefselverwerking en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot light-sheet- of confocale microscopiesystemen en reagentia voor optische klaring.
- Vereist standaardisatie van kleuringsprotocollen, antilichaamvalidatie en beeldparameters tussen teams.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van de methode naar menselijke of grotere zoogdierniermonsters.
- Beperkt door weefselgrootte en de penetratiediepte van antilichamen, wat de uniformiteit van de kleuring in grotere organen kan beïnvloeden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Waarom is whole-mount kleuring van de nier belangrijk voor targetvalidatie?
Het maakt directe visualisatie van de expressie van het doeleiwit in sympathische zenuwen en vasculaire structuren binnen intact weefsel mogelijk, wat mechanistische risicoreductie ondersteunt door on-target binding in neurovasculaire eenheden te bevestigen zonder artefacten door doorsneden.
Hoe draagt het isoleren van de sympathische innervatie als onafhankelijke variabele bij aan beslissingen in de discovery pipeline?
Door te kleuren voor tyrosinehydroxylase en alfa-gladspieractine isoleert de methode de bijdrage van sympathische zenuwen aan de vasculaire tonus, waardoor onderzoekers kunnen beoordelen hoe specifieke targets de interacties tussen zenuwen en arteriën moduleren in preklinische modellen.
Welke kwantitatieve metingen uit driedimensionale beeldvorming maken lead-identificatie mogelijk?
De techniek biedt ruimtelijke metrieken zoals zenuwdichtheid, nabijheid tot arteriën en vertakkingspatronen, die dienen als kwantitatieve uitkomsten om de effecten van verbindingen op de renale innervatie te vergelijken tijdens lead-optimalisatie.
Waarom zijn replicatie-eisen essentieel voor cross-functionele samenwerking bij beeldvormingsgebaseerde assays?
Gestandaardiseerde stappen voor het helder maken, kleuren en beelden maken garanderen reproduceerbare driedimensionale gegevens over verschillende teams heen, waardoor groepen op het gebied van discovery biology, farmacologie en veiligheid resultaten kunnen vergelijken met behulp van consistente neurovasculaire benchmarks.
Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist voordat deze beeldgevingsmethode in drug discovery wordt geïmplementeerd?
Implementatie vereist instrumenten voor ruimtelijke statistiek om de zenuwdistributie, co-lokalisatiecoëfficiënten en morfometrische veranderingen te analyseren, wat een objectieve vergelijking van behandelgroepen mogelijk maakt en go/no-go-beslissingen ondersteunt op basis van vooraf gedefinieerde effectdrempels.
07:46
ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging
Gerelateerde video's
0 Bekeken
10:40
Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
08:17
Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
06:43
Fluid Aspiration from Mouse Glomeruli: A Method to Aspirate Glomerular Fluid from Mouse Using Two-Photon Mediated Micropuncture
Gerelateerde video's
0 Bekeken
03:14
Eosin Staining of Soft-Tissue Samples: An Eosin-Based Procedure for Whole Mouse Kidney Staining to Visualize Specific Tissue Microstructures
Gerelateerde video's
0 Bekeken
06:18
Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
07:01
3D-beeldvorming van zachte weefselmonsters met behulp van een X-Ray-specifieke kleurings methode en nanoscopische computertomografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
12:49
Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
07:38
Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties
Gerelateerde video's
0 Bekeken
07:35
Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026