An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 5:27 min • July 8th, 2025
Take three samples of hippocampal neuronal cultures on coverslips.
Introduce primary antibodies to label the surface-expressed glutamate receptors.
Add a conditioned medium to the second and third samples to induce endocytosis of the antibody-bound receptors.
On the third sample, add Fab fragments to block epitopes on the non-endocytosed antibodies.
Introduce an inhibitor to block receptor endocytosis while allowing receptor recycling to the surface.
In all samples, fix the cells and add a blocking solution to prevent non-specific labeling.&
Introduce fluorophore-tagged secondary antibodies to label the primary antibodies on the surface-bound receptors, including the recycled ones.
Permeabilize the cellular membranes.
Add the primary antibody again to the first sample to label the pre-existing endocytosed receptors.
Introduce a different fluorophore-tagged secondary antibody to all samples to label the endocytosed receptor-bound primary antibodies, distinguishing between endocytosed and surface-bound receptors.
Using a confocal microscope, quantify the surface-expressed, endocytosed, and recycled receptors in the different treatments.
To begin this procedure, transfer the coverslips cell-side up to a paraffin film-covered tray to save reagents and facilitate manipulation. Save and maintain conditioned media at 37 degrees Celsius for incubation and washing steps.
Incubate the cells with primary antibodies diluted in conditioned media at room temperature for 15 minutes. After this, use a vacuum pipette to carefully aspirate off the antibody-containing media and wash the cells three times with conditioned media.
If studying surface versus intracellular receptor expression, fix the cells with paraformaldehyde after this step as outlined in the text protocol. Maintain the cells in conditioned media without antibodies and return them to the incubator at 37 degrees Celsius to allow for internalization. If studying internalization process, fix the cells with paraformaldehyde after this step, as outlined in the text protocol.
To block the epitopes on the primary antibody attached to the surface-expressed receptors that have not been internalized, incubate cells with unconjugated Fab anti-IgG antibody fragments diluted in conditioned media for 20 minutes at room temperature. After this, wash the cells three times with conditioned media. Incubate the washed wells with conditioned media containing 80 micromolar dynasore at 37 degrees Celsius to allow for recycling of internalized receptors.
After finishing the modifications on live cells, wash the cells once with PBS+. Add a solution of 4% paraformaldehyde and 4% sucrose in PBS to the cells, and incubate in a fume hood at room temperature for 7 to 8 minutes to fix the cells. Then, wash the cells three times with regular PBS. Add a solution of 10% normal goat serum in PBS to the cells, and incubate at room temperature for 30 minutes to block nonspecific binding sites.
Next, incubate the cells with fluorescently-tagged secondary antibody diluted in 3% NGS in PBS at room temperature for one hour to label primary antibody-labeled receptors. After this, wash the cells three times with PBS.
To begin labeling the intracellular receptors, add a solution of 0.25% Triton-X in PBS and incubate at room temperature for 5 to 10 minutes to permeabilize the cells. Then, block with 10% NGS at room temperature for 30 minutes. If studying surface versus total, incubate the cells with the same primary antibody used previously, diluted in 3% NGS in PBS at room temperature for one hour to label the intracellular receptors.
Next, wash the cells three times with PBS. Label with second fluorescently-tagged secondary antibody diluted in 3% NGS in PBS at room temperature for one hour. After this, wash the cells three times with PBS. First, gently place the coverslips, cell-side down, on 12 to 15 microliters of the appropriate mounting media to mount the cells. Then, image the cells on the appropriate confocal microscope, and analyze the cells as outlined in the text protocol.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van de dynamiek van glutamaatreceptoren in neuronale hippocampusculturen. Het beschrijft in detail de methoden voor het labelen, fixeren en kwantificeren van oppervlakte-geëxpresseerde, geendocytoseerde en gerecyclede receptoren met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Receptordynamiek
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van glutamaatreceptoren is essentieel voor inzicht in synaptische transmissie.
- Endocytose en recycling van receptoren spelen een belangrijke rol in neuronale signalering.
- Confocale microscopie maakt gedetailleerde visualisatie van de receptorlokalisatie mogelijk.
- Deze studie richt zich op de methodologie voor het analyseren van receptorexpressie in gekweekte neuronen.
Doel van de studie
- Om de mechanismen van endocytose en recycling van glutamaatreceptoren te onderzoeken.
- Om onderscheid te maken tussen op het oppervlak tot expressie gebrachte en geïnternaliseerde receptoren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers die receptordynamiek bestuderen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hippocampale neuronenculturen op dekglasjes.
- Toepassing van primaire antilichamen om glutamaatreceptoren te labelen.
- Gebruik van geconditioneerde media om endocytose te induceren.
- Kwantificering van receptordynamiek met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labelings van oppervlakte- en geendocyteerde glutamaatreceptoren.
- Demonstratie van receptorrecycling onder specifieke omstandigheden.
- Kwantitatieve analyse van receptorlokalisatie bij verschillende behandelingen.
- Validatie van het protocol voor toekomstige studies naar receptordynamiek.
Conclusies
- Het protocol maakt effectief onderscheid tussen oppervlakte- en geïnternaliseerde receptoren.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van het transport van glutamaatreceptoren.
- Deze methodologie kan worden toegepast op diverse studies binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt een nauwkeurige onderscheiding mogelijk tussen oppervlakte- en geïnternaliseerde populaties van glutamaatreceptoren, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij targetvalidatie voor aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. Door de dynamiek van receptortransport te kwantificeren, biedt het voorspellende zekerheid bij het beoordelen van de effecten van verbindingen op de synaptische functie en neuronale signaleringspaden. De aanpak ondersteunt vroege discovery door het gedrag van receptoren te verduidelijken onder farmacologische of genetische perturbaties die relevant zijn voor neuropsychiatrische indicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de transportmechanismen van glutamaatreceptoren mogelijk om functionele target-interactie te valideren.
- Operationele waarde: Maakt onderscheid tussen aan het oppervlak tot expressie gebrachte en geïnternaliseerde receptorpools met behulp van differentiële antilichaamlabeling en fluorofoor-conjugatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in receptor-endocytose en recycling voor lead-optimalisatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve confocale imaging-uitlezingen van oppervlakte-, geendocytoseerde en gerecycleerde receptorpopulaties onder gecontroleerde omstandigheden.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde fixatie, permeabilisatie en sequentiële antilichaamlabeling om consistente discriminatie van receptor-subsets te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well formaten en geautomatiseerde imaging voor medium-throughput screening van farmacologische modulatoren.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Transport van glutamaatreceptoren is betrokken bij tekortkomingen in de synaptische plasticiteit die geassocieerd worden met neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen.
- Translationele continuïteit: Biedt een mechanistische brug van in vitro receptordynamiek naar preklinische modellen van CNS-dysfunctie.
- Risicobeperking: Maakt vroege detectie mogelijk van verbindingen die het receptortransport verstoren, waardoor uitval in een laat stadium door onverwachte neuronale effecten wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De techniek past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt mechanistische inzichten die bijdragen aan beslissingen over de verdere ontwikkeling van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van receptor-traffickingroutes en verduidelijkt de effecten van verbindingen op de lokalisatie van glutamaatreceptoren.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten over de expressie van receptoren aan het oppervlak en internalisatiesnelheden voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt vergelijking van receptorpopulaties tussen behandelingen mogelijk via kwantificatie met confocale microscopie om SAR- en potentiebeoordelingen te onderbouwen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro traffickingdata met preklinische continuïteit door verbindingen te identificeren die de fysiologische receptorcyclus behouden of verstoren.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor de evaluatie van op het CZS gerichte verbindingen over meerdere projecten en doelwitklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistische risicoreductie door te verduidelijken of verbindingen de oppervlaktebeschikbaarheid van glutamaatreceptoren beïnvloeden in plaats van de totale expressie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde workflows voor antilichaamtoevoeging, permeabilisatie en labeling met dubbele fluorforen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door subcellulaire werkingsmechanismen te onthullen die functionele uitkomsten in neuronale netwerken kunnen voorspellen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van effecten op receptorrecycling, een belangrijke determinant van synaptische veerkracht.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met primaire neuronale culturen, antilichaamlabeling en confocale microscopie.
- Afhankelijk van de toegang tot fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, permeabilisatiemiddelen (bijv. Triton-X) en endocytose-modulatoren (bijv. dynasore).
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de timing van fixatie, antilichaamconcentraties en protocollen voor beeldanalyse.
- Aanpassing aan andere receptortypen of neuronale modellen vereist validatie van de antilichaamspecificiteit en de transportkinetiek.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in de preparatie van primaire culturen en de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de blokkerings- en permeabilisatiestappen om artefacten te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Muizen-lymfocyt Labeling door
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026