A Snap Chip Technology for a Cross-Reactivity-Free Multiplexed Sandwich Immunoassay
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 4:36 min • July 8th, 2025
Begin by assembling a pre-treated microarray assay slide with distinct spots containing protein-specific capture antibodies for multiple protein detection.
Load the dilutions of the protein standard and the pre-diluted serum samples into separate wells. These dilutions create a range of protein concentrations for accurate quantification.
Incubate to facilitate protein-antibody interactions. Wash to remove unbound proteins, disassemble, and dry the slide.
Invert the assay slide in a snap apparatus containing a rehydrated transfer slide spotted with protein-specific biotinylated detection antibodies in the same positions as the assay slide.
Close the apparatus and press to snap the slides over each other. This facilitates the transfer of the detection antibodies to corresponding spots on the assay slide, minimizing the cross-reactivity.
Separate the slides to allow the interaction of detection antibodies with bound proteins, forming immunocomplexes.
Reassemble the assay slide, rinse it, and introduce fluorophore-conjugated streptavidin, interacting with biotinylated antibodies.
Using a scanner, detect fluorescence spots at various locations, indicating multiple proteins in the serum sample. Compare the spot intensities with the standard for protein quantification.
To begin the immunoassay, remove the prepared assay slide from the freezer and allow it to warm to room temperature in its sealed bag for 30 minutes. Prepare seven serially diluted solutions of proteins in PBS with 0.05% polysorbate-20. Prepare appropriately diluted sample solutions in the same buffer.
Clamp a 24-well silicone gasket onto the room-temperature assay slide. Load the seven protein dilutions into seven of the eight wells in a column. Load protein-free PBS with 0.05% polysorbate-20 into the last well of that column. Load the sample solutions into the remaining wells.
Shake the slides at 450 RPM for 1 hour at room temperature or at 4 degrees Celsius overnight. Then, wash the slide three times. Remove the gasket and dry the slide under a stream of nitrogen gas.
Next, allow the detection antibody transfer slide to warm to room temperature for 30 minutes in its sealed bag. Then, incubate the slides for 20 minutes in a closed chamber with a relative humidity of 60% to rehydrate the arrays. Use the pogo pins to fix the detection transfer slide face-up in the snap apparatus.
Place the assay slide face-down on the pogo pins, and align the slide with the straight pins. Close the apparatus and snap-transfer the detection antibodies to the assay slide. Remove the slides from the apparatus and incubate the assay slide for one hour.
Clamp a 24-well silicone gasket to the slide, and wash the slide three times. Then, load into each well 80 microliters of a 2.5 microgram per milliliter solution of streptavidin fluorophore in PBS. Shake the slide at 450 RPM for 20 minutes.
Wash the slide three times with a 0.1% solution of polysorbate-20 in PBS, and once with distilled water. Then, remove the gasket and dry the slide. Scan the slide with a fluorescent scanner and measure the spot intensities. Determine the limits of detection and the protein concentrations.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor een microarray-assay gericht op het detecteren van meerdere eiwitten in serummonsters. De methode maakt gebruik van eiwitspecifieke capture-antilichamen en gebiotineerde detectie-antilichamen om een nauwkeurige kwantificering van eiwitconcentraties mogelijk te maken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Eiwitdetectie
- Immunoassays
- Kwantitatieve analyse
Achtergrond
- Microarray-assays maken de gelijktijdige detectie van meerdere eiwitten mogelijk.
- Het gebruik van specifieke antilichamen verhoogt de nauwkeurigheid van de eiwitkwantificering.
- Fluorescentiescanning biedt een gevoelige methode voor het meten van eiwitconcentraties.
- Een juiste monstervoorbereiding is essentieel voor betrouwbare resultaten.
Doel van de studie
- Om een robuust protocol te ontwikkelen voor eiwitdetectie in serummonsters.
- Om nauwkeurige kwantificering te waarborgen via een reeks verdunningen.
- Om kruisreactiviteit tijdens het detectieproces te minimaliseren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van microarray-assaydia's met capture-antilichamen.
- Laden van eiwitstandaarden en serummonsters in de wells.
- Incubatie- en wasstappen om eiwit-antilichaaminteracties te faciliteren.
- Fluorescentiescan om eiwitten te detecteren en te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle overdracht van detectieantilichamen naar de assay-dia.
- Vorming van immuuncomplexen die een nauwkeurige meting mogelijk maken.
- Kwantificering van eiwitconcentraties op basis van fluorescentie-intensiteit.
- Vaststelling van de detectielimieten voor de assay.
Conclusies
- Het beschreven protocol biedt een betrouwbare methode voor eiwitdetectie.
- Nauwkeurige kwantificering is haalbaar door zorgvuldige monstervoorbereiding en uitvoering van de methode.
- Deze aanpak kan worden toegepast in diverse onderzoekssituaties waarin eiwitanalyse vereist is.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze snap-chiptechnologie maakt multiplexeiwitdetectie zonder kruisreactiviteit mogelijk, waarmee een belangrijke uitdaging bij de validatie van biomarkers en de ontwikkeling van assays wordt aangepakt. Door een nauwkeurige overdracht van reagentia zonder contaminatie te waarborgen, ondersteunt het de betrouwbare kwantificering van meerdere targets in complexe biologische matrices zoals serum. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door reproduceerbare, kwantitatieve immunoassaygegevens te leveren voor workflows voor targetvalidatie en leadidentificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de gelijktijdige detectie van meerdere eiwitbiomarkers in ziekte-relevante systemen.
- Operationele waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door kruisreactiviteit te minimaliseren, waardoor de doelspecificiteit en het vertrouwen in beoordelingen van padmodulatie worden verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het genereren van kwantitatieve, reproduceerbare gegevens over target engagement en biologische respons onder verschillende condities.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van specifieke detectie van eiwitdoelen met een lage achtergrond.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay via snap-transfermechanieken die variabiliteit bij het spotten en kruiscontaminatie elimineren.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform en het genereren van consistente read-outs, wat betrouwbare evaluatie van verbindingen in gemultiplexte formaten mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Handhaaft de consistentie van de assay van ontdekking tot preklinische validatie door de ruimtelijke uitlijning van capture- en detectiereagentia te behouden.
- Biomarkerauslijning: Ondersteunt translationele biomarkerstudies door nauwkeurige kwantificering van proteïnepanels in serummonsters over een bepaalde periode mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Levert kwantitatieve resultaten die go/no-go-criteria informeren op basis van targetmodulatie en pathway-activiteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, en ondersteunt hypothesegestuurde eiwitprofilering en assay-gereedheid voor downstream-toepassingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door multiplexeiwitdetectie mogelijk te maken in cellulaire lysaten of biovloeistoffen onder experimentele omstandigheden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten die vergelijking van eiwitexpressie of -modulatie tussen behandelingsgroepen mogelijk maken.
- Analytics: Genereert fluorescentie-intensiteitsmetingen die statistische vergelijking en normalisatie tussen replica's en condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door serumgebaseerde biomarkerkwantificatie te bieden die klinische assay-formaten weerspiegelt.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbare platformmogelijkheid voor immunoprofilering over verschillende projecten heen, waardoor de inspanning voor herontwikkeling wordt verminderd en de doorvoer wordt verhoogd.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie, vermindering van fout-positieven door kruisreactiviteit en verbeterde mechanistische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en verminderde technische variabiliteit bij de uitvoering van gemultiplexte immunoassays.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie door multiplexing en verminderd biologisch risico bij de selectie van kandidaten.
- Impact op het portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van multi-parameter targetprofielen en pathway-dekking.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van immunoassays, antilichaamkoppelingen en fluorescentiedetectiesystemen.
- Afhankelijk van toegang tot microarray-print- of spottingapparatuur, een snap-apparaat en een fluorescentiescanner.
- Vereist cross-team standaardisatie van reagenspreparatie, incubatiecondities en wasprotocollen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende monstertypes (bijv. serum, plasma, lysaat) en detectielimieten op basis van de affiniteit van het antilichaam.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van specifieke antilichaamparen van hoge kwaliteit en potentiële signaalverzadiging bij hoge proteïneconcentraties.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Kraal gebaseerd Multiplex Assay voor analyse van Tear Cytokine profielen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multiplex Cytokine profilering van gestimuleerd muis Splenocytes met behulp van een kraal cytometrische gebaseerde Immunoassay Platform
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026