Name: Detectie van histon Wijzigingen in bladeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie voor het detecteren van histonmodificaties in plantengenen met Arabidopsis. Deze methode biedt inzicht in genregulatie en fysiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"> Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Stichting voor Wetenschappen (DFG) en de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen. </p>

<p class="jove_title"> 1. Verknoping van plantmateriaal </p><ol><li> Oogst 1-2g van Arabidopsis bladeren (6 tot 10cm rozet diameter) in een 50 ml plastic buisje en vul tot 40 ml met de verknoping buffer. </li><li> Zorg ervoor dat bladeren blijven ondergedompeld, bijvoorbeeld door het vullen een op maat gemaakte filter spons recht boven buffer oppervlak. Plaats dan buizen in een exsiccator. </li><li> Vacuüm infiltreren voor 10min. Aan elke buis 2,5 ml toe te voegen van 2M glycine tot verknoping te stoppen en omkeren buizen op gelijke spreiding van glycine rechtvaardigen. </li><li> Vacuüm infiltreren voor een ander 5min en gooi vloeistof tijdens het oogsten bladeren op een zeef. </li><li> Was de bladeren tweemaal met 1 liter water in een bekerglas, dan droge bladeren grondig met papieren handdoeken. </li><li> Verzamel bladeren in een nieuwe plastic buis en vriezen in vloeibare stikstof. Bewaar vertrekt bij -80 ° C tot chromatine isolatie. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Isolatie van chromatine </p><ol><li> Bladeren werden grond met mortel en stamper die in vloeibare stikstof bewaard tot gebruik. </li><li> Overdracht poeder om een ​​50-mL plastic buis en schorten 30 ml extractiebuffer # 1. </li><li> Incubeer 15 minuten bij 4 ° C op een overhead shaker. </li><li> Filtraat ophanging door middel van vier lagen van miracloth in een verse 50-mL plastic buis. </li><li> Spin voor 20min bij 2.800 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en schorten pellet met een kwast in 1 ml extractiebuffer # 2. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 2, en dan pellet te schorten met een kwast, en voeg vervolgens de rest van de buffer. </li><li> Overdracht vering om een ​​1,5 ml microfugebuis en spin voor 10min bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Ondertussen bereiden 2 ml-microfugebuizen buisjes met 1,5 ml extractiebuffer # 3. </li><li> Verwijder het supernatans van de gesponnen buis (stap 2.7) en te schorten pellet in 300μL extractiebuffer # 3. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 3, te schorsen pellet met een kwast, en voeg de resterende buffer. </li><li> Voorzichtig pipet de gesuspendeerde pellet (stap 2.9) op de top van de 1,5 mL extractiebuffer # 3 bereid in stap 2.8. Zorg ervoor dat de twee fasen zal niet mengen. Spin voor 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en schorten chromatine pellet met een kwast in 300μL van ultrasoonapparaat buffer. </li><li> Sonificeer chromatine met een sonotrode, of in een ultrasoon bad, om een ​​DNA-grootte van ongeveer 400bp. Wanneer sonicating, zorg ervoor dat chromatine niet verwarmd boven ongeveer 30 ° C tot warmtegevoelige crosslinks te beschermen. De duur van ultrasoonapparaat moet experimenteel worden bepaald, omdat deze varieert aanzienlijk tussen verschillende ultrasoonapparaat apparaten. Voor begeleiding, zijn de instellingen voor twee verschillende apparaten op voorwaarde dat: </li></ol><p class="jove_content"> Voor ultrasoonapparaat met een Bandelin merk sonotrode bloot chromatine in 0,6 ml microfugebuis vijf keer tot 20 barst met instellingen 25% vermogen, cyclus = 50. Terwijl u dit doet, koele monster na iedere 20 <sup>ste</sup> barst in een ijsbad. </p><p class="jove_content"> Voor ultrasoonapparaat met een Diagenode Bioruptor ultrasoonbad, vul bad met water en ijs en ultrasone trillingen tien keer gedurende 30 seconden in 1,5 ml microfuge tubes met het instellen van 'hoog'. Na elke 30 seconden, koele monsters voor nog eens 30 seconden. </p><ol start="13"><li> Spin gesoniceerd steekproef voor 5 min bij 16.000 g bij 4 ° C voor het neerslaan van onopgelost materiaal. Het supernatant kan direct gebruikt worden voor de immunoprecipitatie. Als alternatief kan monsters shock ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot verder gebruik. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunoprecipitatie </p><ol><li> Bereid 2-mL microfugebuizen buisjes met 40μL proteïne-A agarose en 1.8mL van antilichaam-binding buffer. Voeg 200μL van het chromatine voorbereiding (stap 2,13). </li><li> Incubeer buizen voor 1 uur op een overhead shaker. </li><li> Gooi proteïne-A-agarose parels en te gebruiken voor het supernatant immunoprecipitatie. </li><li> Verwijderen van een 40μL-hoeveelheid aan chromatine concentratie ('input') te bepalen. </li><li> Voeg 30μL proteïne-A agarose en de hoeveelheid van wijziging-specifieke antilichaam dat wordt aangegeven in de onderstaande tabel van specifieke reagentia en apparatuur om 400μL gesoniceerd chromatine schorsing. </li><li> Incubeer 2.5u of 's nachts op een overhead-schudder bij 4 ° C. </li><li> Spin down kralen voor 2min op 440 x g. </li><li> Was kraal pellet met 900μL van elke wasbuffer (zie onderstaande lijst). Voor elke buffer, incubeer kralen in de buffer voor 10min op een overhead-schudder bij 4 ° C, dan draaien voor 2min op 440 xg, verwijder supernatant, en voeg de volgende buffer. <ol><li> Lage zout wasbuffer </li><li> Hoog zoutgehalte wasbuffer </li><li> LiCl wasbuffer </li><li> TE wasbuffer </li></ol></li><li> Na de laatste wasbeurt, volledig te verwijderen alle resterende buffer. </li></ol><p class="jove_title"> 4. De-verknoping van histonen en DNA, en zuivering van DNA neergeslagen </p><ol><li> Voeg 100μL van de-verknoping buffer naar de agarose pellet en de 40μl 'input' monster uit stap 3.4, mix voor 5min op een vortex-mixer, spin monsters, en incuBate bij 65 ° C gedurende de nacht. </li><li> Zuiver DNA met een commerciële DNA-of PCR zuivering kit. </li><li> Typisch 5μl van een 1:05 verdunning van de laatste kolom eluaat voldoende zijn om uit te voeren conventionele locus-specifieke real-time kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. Tabel van buffers </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Verknoping buffer</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyraat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Formaldehyde </td><td> 3% (v / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extractiebuffer # 1</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyraat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Compleet proteaseremmer </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extractiebuffer # 2</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyraat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Compleet proteaseremmer </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extractiebuffer # 3</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyraat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,15% (w / v) </td></tr><tr><td> Compleet proteaseremmer </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Ultrasoonapparaat buffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 25MM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Compleet proteaseremmer </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Antilichaambinding buffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Lage zout wasbuffer</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Hoog zoutgehalte wasbuffer</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl wasbuffer</strong> </td></tr><tr><td> Lithiumchloride </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Natrium desoxycholaat </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20MM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE wasbuffer</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking buffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 6,8 </td><td> 62,5 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200MM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10 mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. Representatieve resultaten: </p><p class="jove_content"> Expressie van de <em>Arabidopsis thaliana PR2</em> verdediging gen dat codeert voor een β-1,3-glucanase met antimicrobiële activiteit <sup>12,</sup> werd geïnduceerd door benzothiadiazole (BTH), een synthetisch analoog van het plantenhormoon salicylzuur <sup>3.</sup> <strong>Figuur 1</strong> toont aan dat activatie van <em>PR2</em> expressie geassocieerd is met een toename van de acetylering van lysine residuen op histon H3 en H4 op de <em>PR2</em> promotor. Sinds nucleosoom dichtheid afneemt tijdens gen activatie <sup>13,</sup> werden histonacetylering waarden genormaliseerd voor het signaal verkregen met een antilichaam tegen een invariant gebied van histon 3. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"><br> <strong>Figuur 1 BTH induceert histonacetylering op de <em>PR2</em> promotor in Arabidopsis.</strong> Planten werden behandeld met 100 urn BTH of een spuitpoeder controle. Na 72h, werden bladeren verzameld en chromatine werd geïsoleerd. Het signaal verkregen na precipitatie met acetylering-specifieke antilichamen (zoals aangegeven in de figuur) werd genormaliseerd om het signaal verkregen door precipitatie met een antilichaam tegen een invariant domein van histon H3. Neergeslagen chromatine werd gekwantificeerd door RT-qPCR. De gegevens zijn gestandaardiseerd voor histon-eiwitten niveaus in de afwezigheid van BTH behandeling. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> Geen belangenconflicten verklaard. </p>

<p class="jove_content"> Meest kritische stappen in het protocol zijn de verknoping van DNA en histonen, de soort en hoeveelheid van bladmateriaal, slijpen van het materiaal, en de sonicatie van chromatine. Voor een meer gedetailleerde bespreking van deze onderwerpen, zie refs. 9 en 10. </p><p class="jove_step"> Sonicatie en verknoping: </p><p class="jove_content"> Het is belangrijk om chromatine te verstoren tijdens de sonicatie om fragmenten van ongeveer 400bp. Uitputtend sonicatie zal vernietigen chromatine door het verstoren van DNA en histonen, overwegende dat onvoldoende sonicatie zal verlaten lang chromatine fragmenten. Deze invloed op de specificiteit van de methode, omdat histonmodificaties distaal van de onderzochte locus kan niet worden gediscrimineerd van lokale aanpassingen. Sonicatie efficiency is het beste getest door het verzamelen van 20μL chromatine van de monsters voor en na sonicatie, de-crosslinking DNA en histonen, het isoleren van het DNA en het bepalen van de lengte van het geschoren DNA door agarose gelelektroforese. RNAse moet worden toegevoegd aan de monsters voor elektroforese, want het chromatine voorbereiding nog steeds bevat grote hoeveelheden RNA in dit stadium van zuivering die kunnen interfereren met de visualisatie van gefragmenteerd DNA. De monsters zijn handig voor het chromatine immunoprecipitatie als DNA van niet-geschoren chromatine langer is dan 10kbp, terwijl DNA van geknipte chromatine vormt een uitstrijkje met een maximale intensiteit van het signaal rond 400bp van DNA. </p><p class="jove_content"> We routinematig gebruik van 3% (v / v) voor formaldehyde chromatine verknoping in intact laat, maar 1% (v / v) formaldehyde kan voldoende zijn in de meeste gevallen. In onze handen, een lage formaldehyde-concentraties zorgen voor kortere ultrasoonapparaat tijden en achtergrond signalen in consequent PCR-reacties. Echter, onvoldoende hoeveelheden formaldehyde resulteren vaak in lage reproduceerbaarheid van de PCR-signaal tussen onafhankelijke experimenten. Dit kan te wijten zijn aan onvoldoende penetratie van bladeren met formaldehyde bij lage concentraties. Zorg ervoor dat u uw formaldehyde voorraad vaak wisselen als de verbinding heeft de neiging om te polymeriseren met de tijd. Formaldehyde-oplossingen zijn stabiel slechts voor ongeveer een maand, en deze periode is nauwelijks verlengd met methanol stabilisatie. Het is aan te raden om verschillende concentraties formaldehyde-test bij het opzetten van experimentele omstandigheden. </p><p class="jove_step"> Hoeveelheid plantaardig materiaal en slijpen: </p><p class="jove_content"> Het is belangrijk om kleine hoeveelheden van bladmateriaal infiltreren in een groot volume van de buffer aan de bladeren aan elkaar plakken te voorkomen. Blad kleven resulteert vaak in onvoldoende infiltratie van formaldehyde. Bovendien zal te veel plantmateriaal blokkeren poriën van de miracloth weefsel. Het slijpen rendement is sterk afhankelijk van het gebruik van een mortier en een stamper met de perfecte pasvorm. We routinematig slijpen met een vloeibare stikstof gekoelde stamper en vijzel in de afwezigheid van extra vloeibare stikstof drie keer voor 50 seconden totdat het materiaal wordt gemalen tot een fijn poeder. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Eiwit-A-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 134 515 001 </td><td> hangt af van het antilichaam klasse </td></tr><tr><td> Eiwit-G-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 243 233 001 </td><td> hangt af van het antilichaam klasse </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> gebruikten we 1μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-acetyl-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> gebruikten we 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimethyl-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-dimethyl-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> gebruikten we 5μL </td></tr><tr><td> Anti-monomethyl-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> gebruikten we 1μL om histon dichtheid controleren </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 AAN </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> Compleet proteaseremmer </td><td> Roche </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van histon wijzigingen in bladeren

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content"> Chromatine structuur is belangrijk voor de regulatie van genexpressie in eukaryoten. In dit proces, chromatine remodeling, DNA methylatie, en covalente wijzigingen op de amino-terminale staarten van histonen H3 en H4 spelen een essentiële rol <sup>1-2.</sup> H3 en H4 histon-modificaties omvatten methylatie van lysine en arginine, acetylering van lysine, en de fosforylatie van serine residuen <sup>1-2.</sup> Deze wijzigingen zijn ofwel geassocieerd met gen-activering, repressie, of een gespannen toestand van het gen dat er meer snelle en robuuste activering van meningsuiting steunen na de waarneming van de juiste signalen (microbe-geassocieerde moleculaire patronen, licht, hormonen, etc.) <sup>3-7.</sup> </p><p class="jove_content"> Hier presenteren we een methode voor de betrouwbare en gevoelige detectie van specifieke chromatine modificaties op geselecteerde plantengenen. De techniek is gebaseerd op de verknoping van de (gewijzigde) histonen en DNA met formaldehyde <sup>8,9,</sup> extractie en sonicatie van chromatine, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met modificatie-specifieke antilichamen <sup>9,10,</sup> de-verknoping van histon-DNA complexen, en gen-specifieke real-time kwantitatieve PCR. De aanpak is nuttig gebleken voor het opsporen van specifieke histon modificaties geassocieerd met C <sub>4</sub> fotosynthese in maïs <sup>5,11</sup> en systemische immuniteit in Arabidopsis <sup>3.</sup> </p>

<p class="jove_content">Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.</p>

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Chromatinestructuur is belangrijk voor de regulatie van genexpressie in eukaryoten. Bij dit proces spelen chromatinremodellering, DNA-methylering en covalente ...

<p>De volgende methode biedt een betrouwbare en gevoelige detectie van specifieke chromatine-modificaties op geselecteerde plantengenen. Crosslink eerst de gemodificeerde histonen en het DNA met formaldehyd. Extraheer en soniceer vervolgens het chromatine om immunoprecipitatie met modificatiespecifieke antilichamen te vergemakkelijken.</p><p>Analyseer ten slotte de ChIP-reactie door middel van crosslinking van histon-DNA-complexen en genspecifieke real-time kwantitatieve PCR. Bij planten kan deze aanpak moleculaire inzichten verschaffen, zoals de specifieke histonmodificaties geassocieerd met C4-fotosynthese in maïs en systemische immuniteit in Arabidopsis. Het belangrijkste voordeel van chromatine-immunoprecipitatie ten opzichte van bestaande methoden zoals massaspectrometrie is dat deze techniek de detectie van histonmodificaties op geselecteerde sequenties in het plantengenoom mogelijk maakt.</p><p>Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het protocol een paar stappen bevat waarvan de correcte uitvoering essentieel is voor het succes van de procedure. In deze video gebruiken we chip-analyse om inzicht te krijgen in de deregulatie van genexpressie in de modelplant Arabidopsis ANA. De procedure wordt gedemonstreerd door Mic Yakovich, een PhD-student. Begin voor elk monster met het oogsten van twee gram bladeren van Arabidopsis en een plastic buis van 50 milliliter. Vul deze tot de 40 milliliter markering met crosslinking-buffer en plaats een op maat gemaakte filterspons direct boven het bufferoppervlak om ervoor te zorgen dat de bladeren ondergedompeld blijven.</p><p>Plaats de monsters nu in een vacuümdesiccator en filtreer gedurende 10 minuten. Om de crosslinking-reactie te stoppen, voegt u 2,5 milliliters van twee molair glycine toe en mengt u door omkeren. Filtreer vervolgens opnieuw gedurende vijf minuten, terwijl het vacuüm wordt gehandhaafd, en filtreer daarna nogmaals vijf minuten.</p><p>Gooi vervolgens de vloeistof weg terwijl de bladeren op een zeef worden opgevangen. Nadat de bladeren twee keer zijn gewassen met één liter water in een plastic bekerglas, worden de bladeren grondig gedroogd met papieren handdoeken, verzameld in een nieuwe plastic buis en ingevroren in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters bij min 80 °C tot de chromatinisolatie.</p><p>Maal de bevroren monsters tot een fijn poeder met een met vloeibare stikstof gekoelde vijzel en stamper. Breng het poeder over naar een plastic buis van 50 milliliter. Suspendeer het poeder in 30 milliliter extractiebuffer nummer één en incubeer dit gedurende 15 minuten bij vier graden celsius op een overhead-shaker.</p><p>Giet de suspensie door vier lagen spiegeldoek in een nieuwe plastic buis van 50 milliliter. Gooi na centrifugatie het supernatant weg. Gebruik vervolgens een penseel om de pellet te resuspenderen in 50 microliters extractiebuffer nummer twee, en voeg daarna nog eens 950 microliters extractiebuffer toe.</p><p>Stap twee: breng de suspensie over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 10 minuten. Bereid ondertussen twee milliliter microcentrifugebuizen voor die 1,5 milliliter extractiebuffer bevatten. Stap drie.</p><p>Verwijder vervolgens de supernatant om het pellet geleidelijk te suspenderen in 300 µL extractiebuffer. Nummer drie. Voeg eerst een klein volume buffer toe.</p><p>Stap drie: resuspendeer het pellet met een penseel en voeg vervolgens de resterende buffer toe. Breng de monsters nu voorzichtig in laagjes aan bovenop de voorbereide buisjes met 1,5 milliliters extractiebuffer. Stap drie: centrifugeer de monsters gedurende één uur bij 16 000 ×g bij vier graden Celsius, waarbij u ervoor zorgt dat de twee fasen niet mengen.</p><p>Verwijder de supernatant en resuspendeer het chromatinepellet met een penseel in 300 µL sonicatiebuffer; soniceer het chromatine tot een DNA-grootte van ongeveer 400 baseparen. Zorg er tijdens het sonceren voor dat het chromatine niet wordt verhit tot boven ongeveer 30 °C. Om hittegevoelige crosslinks te beschermen, centrifugeert u het gesoniceerde monster om onopgelost materiaal neer te slaan en oogst u de supernatant in microcentrifugebuisjes van twee milliliter die proteïne-agarose en antilichaambindingsbuffer bevatten.</p><p>Voeg 200 µL van de voorbereiding van het monsterchromatine toe. Incubeer de buisjes gedurende één uur op een overhead-schudapparaat. Oogst na centrifugatie de supernatanten van de monsters en neem aliquoten van 30 µL proteïne af.</p><p>Gebruik nieuwe 1,5 milliliter buisjes voor het bepalen van de chromatinconcentratie van het startmateriaal. Reserveer 40 µL van het gesoniceerde chromatine. Voeg vervolgens 400 µL van de gesoniceerde chromatinesuspensie toe aan de 30 µL eiwitstandaard en een passende hoeveelheid modificatiespecifiek antilichaam en incubeer dit overnight op een orbitale schudker door bij vier °C.</p><p>Oogst de beads door middel van centrifugatie gedurende twee minuten bij 440 ×g. Verwijder het supernatant en voer opeenvolgende wasbeurten van 10 minuten uit van de bead-pellets met 900 µL van de respectieve buffer op een overhead-shaker. Verwijder na de laatste wasbeurt alle resterende buffer volledig. Om het DNA van de histonen te bevrijden, voegt u 400 µL D cross linking buffer toe aan de beads en de eerder bewaard gebleven input-sample van 40 µL, vortex gedurende vijf minuten, centrifugeer de samples en incubeer deze gedurende de nacht bij 65 °C.</p><p>Zuiver nu het DNA met een commerciële DNA-zuiveringskit en voer een conventionele locus-specifieke real-time kwantitatieve R-T-P-C-R uit. In dit voorbeeld werd de expressie van het Arabidopsis ANA PR two-defensiegen geïnduceerd door Benzo Diaz ole, een synthetisch analogon van het plantenhormoon salicylzuur. De resultaten tonen aan dat de activering van de PR two-expressie geassocieerd is met een toename van de acetylering van lysineresiduen op histonen H three en H four op de PR two-promotor.</p><p>Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de toevoeging van extractiebuffer één aan het bladpoeder zorgt voor overdruk in de gesloten fcon-buis. Vergeet niet om de buis af en toe te openen. Denk er daarnaast aan om het penseel niet te verwijderen na de suspensie van de pellets en vóór de toevoeging van de volgende buffer.</p><p>Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u histonmodificaties en hun effecten kunt bepalen middels formaldehyde-gebaseerde cross-linking van DNA en histonen, isolatie van chromatinimmunoprecipitatie en locus-specifieke DNA-kwantificering om kernvragen te beantwoorden over de rol van chromatine en de modificaties ervan in verschillende vakgebieden binnen de plantbiologie.</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in <em>Magnaporthe oryzae</em>

Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&amp;Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&amp;Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.

Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren <em>in vivo</em> door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer chromatine immunoprecipitatie voor het detecteren van histonmodificaties in plantengenen met Arabidopsis. Deze methode biedt inzicht in genregulatie en fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Meer video's verkennen