A Method for the High Salt Treatment of Dendritic Cells and their Adoptive Transfer into Mice
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 3:16 min • July 8th, 2025
Begin with a multi-well plate containing a suspension of dendritic cells or DCs.
To mimic a hypertensive condition, add a culture medium containing a high concentration of sodium ions and incubate.
During incubation, sodium ions enter the cell, increasing the intracellular sodium concentration.
This triggers the exchange of intracellular sodium ions with extracellular calcium ions.
Increased internal calcium levels activate pathways that facilitate the generation of reactive aldehydes, which bind to the cellular proteins. This activates the DCs, which display these modified proteins on their surface.
Post-incubation, collect the cells in a tube and centrifuge.
Remove the supernatant. Add fresh buffer to resuspend the cells.
Draw the cell suspension into a syringe.
Take an anesthetized mouse and inject the cell suspension retroorbitally which is an area behind the eye socket.
This process of injecting activated immune cells is called adoptive cell transfer.
Pipette 900 microliters of the DC suspension into a 24-well flat flat-bottom falcon plate. Add 100 microliters of the high salt DC culture media to each well for a final sodium concentration of 190 millimolar. Label the plate, and place it in a humidified carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 48 hours.
After 48 hours, remove the plate from the incubator. Wipe out the cell culture media in a single well up and down to resuspend the CD11c-positive DCs. Transfer all of the suspension into a corresponding labeled 1.6-milliliter tube. Repeat this for each individual well that was plated.
Centrifuge all of the tubes at 300 times g and at four degrees Celsius for 10 minutes. Aspirate the supernatant, and resuspend the DC pellet with 100 microliters of sterile DPBS. Next, draw the DC solution from one of the tubes into a 1-milliliter syringe equipped with a 27-gauge half-inch needle.
Place the naive male, 10-week-old, C57 black six mouse under 2% isoflurane to achieve a stable surgical plane. Check the level of anesthesia with the lack of pedal reflex. Once a stable surgical plane is achieved, slowly and carefully introduce the needle into the retro-orbital space at an angle of approximately 30 degrees.
Slowly and smoothly, inject the CD11c-positive DC suspension. Once the injection is complete, carefully remove the needle for the retro-orbital space, making sure not to damage the eye. Then, remove the mice from the nose cone, and monitor them for approximately 30 minutes during recovery from anesthesia.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het activeren van dendritische cellen (DC's) onder hypertensieve omstandigheden en hun daaropvolgende gebruik bij adoptieve celtransfer. Het proces omvat het manipuleren van de natrium- en calciumionconcentraties om DC's te activeren, die vervolgens in muizen worden geïnjecteerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Hypertensieve omstandigheden kunnen cellulaire activiteiten beïnvloeden.
- Adoptieve celtransfer is een techniek die wordt gebruikt om immuunresponsen te versterken.
- Inzicht in ionenaustausch in cellen is essentieel voor het manipuleren van immuunfuncties.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van de natriumionconcentratie op de activatie van dendritische cellen te onderzoeken.
- Om het proces van adoptieve celoverdracht in muizen te demonstreren.
- Om de implicaties van geactiveerde DC's in immuunresponsen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een dendritische cel-suspensie in een multi-well plaat.
- Incubatie met kweekmedium met een hoge natriumconcentratie.
- Centrifugatie en resuspensie van geactiveerde DC's.
- Injectie van DC's in de retro-orbitale ruimte van geanestheseerde muizen.
Belangrijkste Resultaten
- Een verhoogde intracellulaire natriumconcentratie leidt tot verhoogde calciumgehaltes in DC's.
- Geactiveerde DC's vertonen gemodificeerde eiwitten op hun oppervlak.
- Succesvolle injectie van geactiveerde DC's in muizen is gerealiseerd.
- De methode demonstreert een levensvatbare aanpak voor het bestuderen van immuunresponsen.
Conclusies
- Deze studie biedt inzicht in de mechanismen van dendritische celactivatie.
- De techniek van adoptieve celtransfer kan worden gebruikt voor verdere immunologische studies.
- Toekomstig onderzoek kan de therapeutische toepassingen van geactiveerde DC's verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt mechanistische analyse mogelijk van de activatie van dendritische cellen onder hypertensieve stresscondities, waardoor een gecontroleerd systeem ontstaat om ion-gemedieerde immuunmodulatie te bestuderen. Door het genereren van gedefinieerde neoantigenen via de vorming van isolevuglandine-eiwitadducten, ondersteunt deze methode de validatie van targets in modellen van auto-immuunziekten en inflammatoire ziekten. De workflow voor adoptieve transfer biedt een reproduceerbare aanpak voor de preklinische evaluatie van DC-gebaseerde immunomodulerende strategieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar natrium-calcium ionenuitwisselingspaden als mechanistische drijvers van dendritische celactivatie.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd protocol voor het genereren van antigeen-presenterende DC's met een gedefinieerde neoantigeenlast voor hypothesetoetsing.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij immunomodulatoire targets door ionische stress te koppelen aan functionele DC-output in vivo.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert geactiveerde dendritische cellen met IsoLG-proteïne-adducten op het oppervlak die kwantificeerbaar zijn via flowcytometrie of imaging.
- Reproduceerbaarheid: Een gedefinieerde natriumconcentratie (190 mM) en incubatietijd (48u) maken een consistente activatie van DC's over verschillende experimenten mogelijk.
- Schaalbaarheid: Het multi-wellplaatformaat maakt parallelle verwerking van condities mogelijk voor vergelijkende screening van adjuvantia of modulatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert immuundysregulatie geassocieerd met hypertensie, relevant voor cardiovasculaire en inflammatoire comorbiditeiten.
- Translationele continuïteit: Adoptieve transfer van geactiveerde DC's maakt het volgen van antigeenspecifieke T-celresponsen in muismodellen mogelijk.
- Preklinisch nut: Ondersteunt de evaluatie van DC-gebaseerde interventies in modellen van door hypertensie verergerde autoimmuniteit of transplantatafwstoting.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door een instrument te bieden om dendritische cel-centrische mechanismen te valideren voordat er wordt geïnvesteerd in kostbare therapeutische kandidaten.
- Discovery Biology: Test hoe ionenflux de rijping van DC's en antigeenpresentatie beïnvloedt, waardoor mechanistische verbanden tussen hypertensie en immuunactivatie worden verduidelijkt.
- Screening: Levert kwantificeerbare, gestandaardiseerde geactiveerde DC's voor het screenen van verbindingen die ionkanalen of aldehyde-detoxificatiepaden moduleren.
- Analytics: Maakt meting van DC-activatiemarkers, neoantigeenlast en downstream T-celproliferatie mogelijk als functionele read-outs.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert preklinische beoordeling van DC-therapeutica in modellen waarin ionische disbalans bijdraagt aan pathogenese.
- Herbruik binnen de Organisatie: Het protocol kan worden aangepast voor verschillende muizenstammen en DC-subsets om een herbruikbaar platform voor immunometabolisme-studies op te bouwen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van activeringsroutes van dendritische cellen via gedefinieerde modellering van ionische stress.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, reproduceerbare generatie van neoantigeen-presenterende DC's voor consistente experimentele inputs.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen over immunomodulatoire targets door fysiologische stressfactoren te koppelen aan immuunuitkomsten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van DC-gebaseerde therapieën mogelijk bij cardiovasculaire-immuun crossover-indicaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie en kweek van dendritische cellen en flowcytometrische validatie van oppervlaktemarkers.
- Afhankelijk van een CO2-incubator, centrifuge en instrumentatie voor retro-orbitale injectie met anesthesiemonitoring.
- Vereist standaardisatie van de zuiverheid van natriumchloride en osmolariteitscontroles tussen laboratoria.
- Aanpassing aan menselijke DC-subsets kan optimalisatie van de natriumtolerantie en adductdetectiemethoden vereisen.
- Beperkt tot murine modellen; extrapolatie naar de menselijke fysiologie vereist validatie van analoge iongevoelige pathways.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen naar bleomycine-geïnduceerde muismodellen om hun effect op idiopathische longfibrose in vivo te bestuderen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bioluminescente monitoring van transplantaatoverleving in een adoptief transfermodel van auto-immuundiabetes bij muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026