Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 2:41 min • July 8th, 2025
Begin with a culture of mouse embryonic stem cells.
Wash the cells with a buffer to remove media and cell debris.
Add an enzyme cocktail to detach cells from the flask surface.
Add media to stop the enzymatic activity and collect the cells in a tube. Centrifuge and discard the supernatant containing enzymes.
Resuspend the cells in serum-free neuronal culture media.
Seed the cells onto gelatin-coated multi-well plate wells.
Incubate. The embryonic stem cells adhere to the gelatin-coated surface. Media constituents, including nutrients, growth factors, and hormones, facilitate cell proliferation and form a monolayer.
At this cell density, the embryonic stem cells produce and release optimal levels of growth factors and cytokines.
These molecules trigger intracellular signaling pathways, facilitating the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.
Mix the gelatin with 500 milliliters of warm PBS and cover the bottom of the cell culture container with just enough of the solution to coat the surface. While the gelatin is coating, rinse the subconfluent culture of mouse embryonic stem cells two times in PBS. Then, add 1 milliliter of dissociation reagent to the culture.
After two to five minutes, tap the vessel to dislodge the monolayer into a single-cell suspension and collect the culture in a total of 10 milliliters of medium and cell dissociation reagent.
Transfer the cells into a 15-milliliter conical tube and spin them down in a centrifuge. Then, after careful aspiration of the supernatant, resuspend the pellet in 10 milliliters of pre-warmed N2B27 pipetting against the side of the tube to avoid creating bubbles.
Now, count the cells recording the concentration and resuspend them at the appropriate number of cells per unit of volume per well in pre-warmed N2B27 according to the table. Then, aspirate the gelatin from the culture vessel and plate the cells without swirling the container.
Place the cultures in a humid incubator at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide, replacing the medium every one to two days with fresh N2B27.
Overzicht
Dit artikel beschrijft het proces van het differentiëren van embryonale stamcellen van muizen tot neurale progenitorcellen. Het protocol omvat het losmaken van cellen, resuspensie en het uitplaten op met gelatine gecoate oppervlakken om adhesie en groei te bevorderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- embryonale stamcellen van muizen kunnen differentiëren tot verschillende celtypen.
- Neurale progenitorcellen zijn essentieel voor het bestuderen van de neuro-ontwikkeling.
- Groeifactoren en cytokinen spelen een cruciale rol bij de celdifferentiatie.
- Juiste kweekcondities zijn noodzakelijk voor een optimale celgroei.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het differentiëren van embryonale stamcellen tot neurale progenitorcellen.
- Om de kweekcondities voor celproliferatie te optimaliseren.
- Om de signaalpaden te onderzoeken die betrokken zijn bij de differentiatie.
Gebruikte methoden
- Kweek van embryonale stamcellen van muizen in een gecontroleerde omgeving.
- Gebruik van een enzymcocktail voor het losmaken van cellen.
- Resuspensie van cellen in serumvrij neuronale kweekmedium.
- Incubatie op met gelatine gecoate platen om adhesie te bevorderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle loskoppeling en resuspensie van embryonale stamcellen.
- Vorming van een monolaag van cellen op met gelatine gecoate oppervlakken.
- Optimale niveaus van groeifactoren en cytokinen werden geproduceerd.
- Cellen differentieerden tot neurale progenitoren onder gespecificeerde omstandigheden.
Conclusies
- Het protocol differentieert muis embryonale stamcellen effectief tot neurale progenitoren.
- Groeifactoren en cytokinen zijn cruciaal voor een succesvolle differentiatie.
- Verdere studies kunnen de toepassingen van deze neurale progenitoren in onderzoek verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het vestigen van een betrouwbare generatie van neurale progenitorcellen uit pluripotente stamcellen maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij de validatie van targets voor neurodegeneratieve ziekten. Deze serumvrije monolaagbenadering ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door biologische variabiliteit in vroege discovery-workflows te verminderen. De methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor de analyse van signaalpaden en het screenen van lead-verbindingen bij geneesmiddelenonderzoek voor het centrale zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen in neurodevelopmentale pathways mogelijk met behulp van een gedefinieerd, serumvrij systeem.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door consistente productie van neurale progenitorcellen uit embryonale stamcellen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door vroege neurale differentiatie te modelleren onder gecontroleerde omstandigheden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert een homogene populatie neurale progenitorcellen die geschikt is voor assays voor compoundscreening.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via monolayercultuur op gelatine-gecoate oppervlakken met gedefinieerde media.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt multi-well plating-formaten voor compoundevaluatie met een medium tot hoge doorvoersnelheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van neurodevelopmentale mechanismen voorafgaand aan in vivo validatie.
- Mechanische risicoreductie: Maakt studies naar pathway-specifieke targetmodulatie mogelijk in een menselijk relevante cellulaire context.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt biomarker-gealigneerde read-outs mogelijk voor target engagement en pathwaymodulatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor een vroege beoordeling van de effecten van verbindingen op neurale differentiatiepaden mogelijk is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking bij de validatie van neuro-ontwikkelingsdoelen.
- Screening: Levert assay-klare neurale progenitorcellen met reproduceerbare adhesie en proliferatie op gecoate substraten.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve read-outs van differentiatie-efficiëntie en markerexpressie mogelijk voor compound-screening.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontdekking met preklinische continuïteit via een gedefinieerd model van neurale progenitorcellen.
- Bedrijfbrede herutilisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor CNS-doelvalidatie over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit bij neurale differentiatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde serumvrije condities en gelatincoating.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van de effecten van verbindingen op de commitment van de neurale lijn mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-targets via betrouwbare, gede-riskte preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek en neurale differentiatietechnieken.
- Afhankelijk van consistente gelatincoating en de bereiding van serumvrije N2B27-media.
- Vereist gestandaardiseerde celzaaidichtheden voor het triggeren van autocriene signalering.
- Omvat routinematige mediumverversingen en monitoring van monolaagvorming en differentiatie.
- Beperkt tot murine embryonale stamcellen; adaptatie naar andere soorten vereist validatie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generating Schwann Cell-Like Cells from Bone Marrow Stromal Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026