Waarom is de cAMP-behandeling van belang voor de activatie van macrofagen in deze assay?

Behandeling met cAMP triggert de activatie van macrofagen door endogene signaleringspaden na te bootsen, wat leidt tot de secretie van cytokinen en chemokinen die de uitgroei van neurieten stimuleren. Deze stap is essentieel voor het genereren van functioneel geconditioneerd medium met neurale extensie-activiteit.

Hoe draagt het isoleren van macrophage-geconditioneerd medium bij aan de validatie van het target?

Het isoleren van geconditioneerd medium maakt het mogelijk om oplosbare factoren afkomstig van macrofagen te beoordelen als potentiële therapeutische targets of biomarkers. Dit stelt onderzoekers in staat om mechanismen te valideren door immuunactivatie te koppelen aan functionele neuronale fenotypes, zonder de verstorende variabelen van co-cultuur.

Wat maken kwantitatieve metingen van neurietuitgroei mogelijk bij compound screening?

Kwantitatieve metingen van neurietuitgroei bieden een functionele, dosisresponsieve readout voor het evalueren van de effecten van verbindingen op macrofaag-gemedieerde neuronale herstelprocessen. Deze metrieken ondersteunen hit-to-lead beslissingen door target-engagement te correleren met fenotypische uitkomsten in een ziekterelevant systeem.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor de bereiding van geconditioneerd medium?

Replicatie waarborgt de consistentie van de macrofaagactivatie en de potentie van het geconditioneerde medium over verschillende experimenten heen, wat essentieel is voor crossfunctionele samenwerking en de vergelijkbaarheid van gegevens. Gestandaardiseerde replicatie ondersteunt de betrouwbaarheid van assays in screening- en lead-optimalisatieworkflows.

Welke statistische analyse is vereist voordat deze assay in screening wordt geïmplementeerd?

De implementatie van deze assay vereist een statistische analyse van de gegevens over de neurietuitgroei, inclusief een variantiebeoordeling en significantietoetsing tussen de behandelings- en controlegroepen. Dit garandeert dat de waargenomen effecten robuust zijn en geschikt voor besluitvorming in campagnes voor de identificatie van lead-verbindingen.

Using a Macrophage Conditioned Medium to Promote Neuron Extensions

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurowetenschap

0 weergaven • 3:32 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Start with cyclic adenosine monophosphate, or cAMP, a signaling molecule that regulates various cellular functions. Add cAMP to a neuron-macrophage co-culture.

The cAMP molecules from the medium and the growth factors from neurons trigger macrophage activation.

Transfer the insert with activated macrophages to another well containing a macrophage culture medium.

Here, the macrophages release cytokines and chemokines into the medium, forming a conditioned medium or CM.

Centrifuge the CM to pellet the cellular components.

Transfer the supernatant and filter to remove the cellular debris.

Add the collected CM to a neuronal culture. The cytokines and chemokines in the collected CM promote the neuron extensions.

Add chilled paraformaldehyde to fix the cells.

Add a blocking buffer to avoid nonspecific binding of antibodies. Wash to remove the residual buffer.

Apply primary antibodies that target the cytoskeletal proteins of the neurons. Wash to remove unbound antibodies.

Add red-fluorophore-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies. Wash to remove unbound antibodies.

Using fluorescence microscopy, visualize the red-colored neurons with extensions.

Four hours after the neuron macrophage have been co-cultured, add 2 microliters of 100 micromolar db-cAMP solution to the neuron macrophage co-cultures. After 24 hours, fill an empty well with 1 milliliter of macrophage culture medium in the same 6-well plate.

Transfer the cell culture insert in the neuron macrophage co-culture to the empty well with macrophage culture medium. After 72 hours, centrifuge the macrophage-conditioned medium at 239 g for five minutes to remove the cellular components. Pass the supernatant through a 0.2-micrometer filter to remove any remaining cellular debris.

In this procedure, precoat an 8-well chamber slide with poly D-lysine and laminin. Then, obtain the associated adult DRG neurons in neurobasal medium, supplemented with B 27. Plate 5 x 10⁴ cells per well onto a precoated 8-well chamber slide.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 1 augustus 2026

Using a Macrophage Conditioned Medium to Promote Neuron Extensions

Overzicht

Belangrijkste componenten van de studie

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Management

Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor Implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Developing a Neuron and Macrophage Coculture In Vitro

Initiating Rapid Neurite Extension and Formation Functional Neuronal Connections

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit