DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een onderscheidende DNA-vingerafdruk van Mycobacterium leprae, de niet-kweekbare bacterie die lepra veroorzaakt, rechtstreeks uit klinische monsters. M. leprae bacterieel DNA, geëxtraheerd uit patiëntbiopten, wordt geamplificeerd via een multiplex PCR met gebruik van fluorescerende primers die specifiek zijn voor de variable number tandem repeat of VNTR loci. Zodra het DNA is geamplificeerd, wordt capillaire elektroforese uitgevoerd voor fragmentlengteanalyse.

De gegevens worden geanalyseerd om het aantal korte tandem-repeat DNA-segmenten per locus te bepalen. Omdat verschillende stammen van EPRI een verschillend aantal tandem-repeats per locus vertonen, leveren gegevens van meerdere loci unieke DNA-vingerafdrukken op. Met deze techniek kan een database van de stamtypen van patiënten worden gegenereerd.

De populatiestructuur, evolutie en transmissie van lepra tussen patiënten in gedefinieerde gemeenschappen en wereldwijd kunnen worden gekenmerkt, wat uiteindelijk genetische hulpmiddelen en bewijsmateriaal levert voor de eliminatie van lepra. Deze methode kan worden gebruikt voor het traceren van de verspreiding van lepra, het identificeren van clusters van recente infecties en risicogroepen, en het meten van de effectiviteit van beheersprogramma's. De procedure zal worden gedemonstreerd door Lee en Ron Jensen, onderzoekers uit mijn laboratorium, en Jason Rivers van onze instrument-kernfaciliteit. Extraheer DNA uit klinische biopsieën met behulp van een standaard KaiGen DNA-extractiekit.

Zodra het DNA is verkregen, wordt er een nieuwe werkruimte ingericht in een schone PCR-kast. Om DNA-contaminatie te voorkomen, wordt de kast en een set pipetten afgeveegd met 70%ethanol en worden de kast en pipetten 15 minuten lang blootgesteld aan UV-licht. Zodra de kast schoon is, kan de multiplex PCR worden opgezet, waarbij voor elke multiplex PCR vier tot vijf primerparen worden gebruikt waarvan één primer per paar fluorescent is gelabeld.

Moet gemengd worden. Gebruik 10 micromolaire primer-stocks bereid in TE-buffer om de primermengsels te maken; meng gelijke hoeveelheden van alle forward- of bovenste primers in een Eppendorf-buisje om een uiteindelijke concentratie van twee micromolair te bereiken. Voeg voor elke primer indien nodig TE-buffer toe.

Meng op dezelfde wijze alle reverse- of lower-primers in een andere buis. Zodra de primer-mengsels zijn bereid, stelt u de PCR MES-mix samen. Maak een plaatoverzicht waarop alle monsters en controles per monster zijn aangegeven.

De mastermix moet 12 µL KaiGen multiplex PCR mix, twee µL van elke primerpool en twee µL Q-oplossing bevatten. Zorg ervoor dat er voldoende mastermix wordt gemaakt om ook de controles op te nemen en om rekening te houden met pipetteerverliezen. Centrifugeer de mastermix kortstondig.

Breng vervolgens 18 µL van de mastermix aan in elke put van een PCR-plaat. Om contaminatie van de DNA-monsters te voorkomen, dient u de handschoenen te wisselen en een aparte veiligheidskast af te nemen en te desinfecteren. Zoals eerder gedaan, plaatst u de plaat in deze kast zodra de zuiveringskap is gedesinfecteerd.

Voeg vervolgens twee µL DNA-monster toe aan elke put met mastermix. Gebruik altijd pipetpunten met aerosolfilter om kruiscontaminatie te voorkomen. Sluit de PCR-platen zorgvuldig af en centrifugeer kort om de inhoud te mengen.

Plaats vervolgens de reactieplaat in de thermocycler en start het PCR-programma voor het indienen van monsters. Bereid voor FLA de formamide-grootte en de mastermix voor, en voeg de verdunde PCR-producten toe in een schone eppendorf-tube: combineer per te testen monster 12 µL hoge formamide-oplossing en 0,3 µL GeneScan 500 LIZ sizing standard. Pipetteer 12,3 µL van deze oplossing per well in een 96-well reactieplaat van optische kwaliteit.

Zodra de PCR is voltooid, wordt de plaat gecentrifugeerd. Zorg ervoor dat de positie van elk monster wordt genoteerd op de platenkaart. Aliquoteer vervolgens in een aparte 96-wells plaat 59 µL nucleasevrij water per well en voeg één µL van elke PCR-reactie per well toe om het geamplificeerde DNA in een verhouding van 1:60 te verdunnen.

Zodra het DNA is verdund, gebruikt u een multichannelpipet om één microliter van elk verdund PCR-monster over te brengen naar de overeenkomstige put van de plaat die de formamide-losse oplossing bevat. Zodra het programma is voltooid, kunnen de monsters worden getest via standaard agarosegelelektroforese om te bevestigen dat de DNA-fragmenten van de voorspelde grootte zijn geamplificeerd. De monsters worden voorbereid voor analyse via fluorescente capillaire elektroforese met behulp van een FLA-genetische analyzer; voeg vóór de analyse een septum toe aan de plaat en centrifugeer kort om luchtbellen te verwijderen en het monster in de put te drukken.

De IDE zal de strengen chemisch denatureren, waardoor hitte-denaturatie niet nodig is. Plaats de plaat in een laadbak. Evalueer het gelabelde PCR-product met capillaire elektroforese, zoals de genetische analyzer 31 30 xl van ABBI.

Analyseer de monsters met behulp van een capillair van 50 centimeter, gevuld met POP-7 polymeer als scheidingsmedium. Het DNA migreert naar het uiteinde van het capillair, waar een laser en detector de fluorescerende labels meten. Open de verzamelsoftware van de analyzer. De analyzer moet voorafgaand aan het analyseren van de monsters worden gekalibreerd om alle gebruikte kleurstoffen te detecteren, inclusief de groottestandaard. De Dset die voor deze monsters is gebruikt, is ABI's G5. De monsters worden elektrokinetisch geïnjecteerd bij 1,6 kilovolt gedurende 15 seconden.

Scheid de fragmenten door 15 kilovolt gedurende 1800 seconden toe te passen. De totale looptijd voor elke run is ongeveer 45 minuten. Zodra de run is voltooid, maakt u gegevensbestanden aan voor elk monster.

De bestanden worden door de verzamelsoftware van de analyzer in een plaatmap op een vooraf bepaalde locatie geplaatst. De bestanden zijn in FSA-formaat. FLA-gegevens kunnen worden geanalyseerd met peak scanner-software, die gratis beschikbaar is op de website van Applied Biosystems.

Klik om gegevens te analyseren op start new project en vervolgens op add files. Laad de geselecteerde gegevensbestanden in het programma, inclusief de positieve en negatieve controles. Selecteer en analyseer de geladen bestanden.

De resultaten worden weergegeven als een FLA-chromatogram. De groottestandaarden verschijnen als oranje pieken, terwijl de gekleurde pieken de bacteriële DNA-monsters vertegenwoordigen voor elke geanalyseerde locus in het monster; klik op een piek om de grootte in baseparen te bepalen. Vanwege slip-strand-synthese door DNA-polymerase zal er voor sommige microsatellietloci een familie van pieken van dezelfde kleur worden gedetecteerd.

In deze gevallen is de geselecteerde piek gewoonlijk die met de grootste amplitude. Vergelijk de fragmentgroottes in elk monster met de grootte van de positieve controle om te bepalen hoeveel tandem-repeatsegmenten aanwezig zijn voor elk getest allel en noteer de gegevens in een Excel-spreadsheet voor verdere analyse. In deze figuur worden de DNA-vingerafdrukken getoond van isolaten van zeven patiënten behorend tot drie verschillende families uit hetzelfde dorp, waarbij het aantal tandem-repeats voor elke geanalyseerde polymorfe locus wordt aangegeven.

Deze gegevens suggereren dat twee leden van familie B zijn geïnfecteerd met dezelfde stam, terwijl één lid is geïnfecteerd met een afwijkende stam. Leden van familie C zijn waarschijnlijk geïnfecteerd met dezelfde stam. Dit geldt ook voor de leden van familie A. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u routinematig multiplex PCR en fragmentlengteanalyse kunt inzetten om V-N-T-R-D-N-A-vingerafdrukken te verkrijgen voor lepra-patiënten die zich melden in klinieken.

Dit zijn nieuwe moleculaire instrumenten ter aanvulling op de conventionele epidemiologie voor de bestrijding van lepra.