Name: DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae met VNTR-typering en fragmentlengteanalyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het traceren van lepraoverdracht en het identificeren van risicogroepen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering werd verstrekt door NIH / NIAID verlenen RO1-AI-63457 en de ARRA subsidie ​​aan te vullen RO1-AI-63457 S1. Wij erkennen de bijdragen van alle huidige en vroegere leden van het laboratorium groep en medewerkers.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li>
<li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li>
<li>Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. , Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).</li>
<li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li>
<li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science%3A+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li>
<li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li>
<li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li>
<li>Weng, X. iaoman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China%3A+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li>
<li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County%2C+Yunnan%2C+China%3A+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li>
<li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu%2C+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li>
<li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Leprosy+Review%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li>
</ol>

De collectie van de huid monsters van lepra patiënten vereist deskundige artsen of technici werken op de huid klinieken. Laboratorium medewerkers die werken met deze monsters moeten besteden veel zorg aan lab jassen, handschoenen en een beschermende bril dragen en om te werken in een bio-safety kast bij de omgang met geïnfecteerde monsters van menselijke of gordeldier weefsel. Desinfectie van oppervlakken en gereedschappen is ook kritisch. Werken in een schone, steriele bio-safe kast is van belang voor het vermijden van verontreiniging van DNA-monsters. DNA-extractie is uitgegroeid tot relatief eenvoudig dankzij de ontwikkeling van de extractie kits van bedrijven als Qiagen. Richtingen moeten zorgvuldig worden opgevolgd. Alle monsters moeten worden bewaard koud wanneer niet in gebruik. Vermijd herhaaldelijk, extreme temperatuurschommelingen voor monsters. DNA-primers gebruikt in dit werk kan worden besteld bij verschillende bedrijven die zijn in de lijst met literatuur referenties aan het einde van deze paper. Voorzichtigheid is geboden om te werken met primers in een DNA-vrije omgeving, om besmetting te voorkomen. Primers komen als droog poeder en moeten worden gemengd met TE en verdund tot een concentratie van 100 urn, dan opgesplitst in kleinere hoeveelheden (Figuur 2a). Werken oplossingen van primers worden verder verdund tot 10μM concentraties. Nogmaals, geen gebruik maken van DNA-monsters in gebieden / kappen waar de primers worden gebruikt en bereid. PCR-producten moeten ook worden bewaard koud wanneer niet in gebruik. Een 3% agarosegel voorbereiding zal geven betere DNA band scheiding, maar duurt het langer te lopen. Voor zuiver kwalitatieve doeleinden, 2% is meestal voldoende. Ethidiumbromide oplossing gebruikt voor het kleuren van de DNA in agarose gels is een zeer actief genotoxin die wordt geabsorbeerd door de huid. Behandel deze oplossing en gels gekleurd met met behulp van grote zorg en altijd zeker om handschoenen te dragen. Handen grondig wassen na het hanteren van een DNA-monsters of ethidiumbromide materialen. Gooi ethidiumbromide kleuroplossing, wassen en gels volgens de institutionele richtlijnen. Gels zijn niet routinematig vereist; deze stap kan worden geëlimineerd zodra FLA methoden zijn vastgesteld. Het is tijd en reagens beslag. De formamide oplossing die wordt gebruikt bij de voorbereiding van monsters voor FLA is ook zeer giftig en moet met zorg worden behandeld. Handen wassen na het gebruik ervan. Gooi het volgende institutionele richtlijnen. Het lezen van de resultaten van het FLA gebruik van Peak Scanner software kan een uitdaging zijn. Een basisset van allel oproepen (aantal tandem repeats) is ontwikkeld bij CSU (tabellen 4-7). (Opgemerkt moet worden dat de tabellen 4-7 misschien niet all inclusive. Als andere stammen van M. leprae worden bestudeerd, allelen met een kopie nummers buiten de vermelde bereik kan worden gevonden.) Een bijzondere uitdaging houdt &#39;stotteren&#39; pieken. Dit zijn families van pieken, vooral van STRs die alleen betrekking 2-3 basepaar herhaalt, zoals (TA) 10. Soms is het selecteren van de juiste piek te lezen is moeilijk (figuur 7). In deze figuur, de piek in de positieve controle op 190 bp is de belangrijkste piek. Pieken lager in hoogte dat zijn 2, 4 of zelfs 6 basenparen groter of kleiner zijn dan de grootste piek worden &#39;stotteren pieken. &quot; A-tailing kan ook leiden tot verwarring. A-tailing is eerder beschreven in de tekst en in figuur 8. Tot slot, als er PCR-producten zijn zeer overvloedig in de monsters, kunnen pieken verschijnen met een dubbele piek. In dit geval, lees dan het midden van de piek te vormen. (Zie Figuur 6, Patiënt 6.) Data management kan een enorme taak voor dit soort werk. Het is belangrijk dat registreert alle relevante informatie voor alle experimenten zoals: de datum van een taak of procedure, operator, strip / plaat kaarten, FLA-orders, PCR-condities en recepten, data van gels en foto&#39;s, opslag temperaturen, DNA-template verdunningen, FLA elektronisch bestand opslaglocaties, etc. Goede organisatie en het data management kan besparen uur van de tijd besteed op zoek naar specifieke delen van informatie in de toekomst. Het laboratorium werk dat hier wordt beschreven is al een aantal jaren bij Colorado State University en op andere locaties in de wereld. Het grote beeld van wat allemaal van de verzamelde gegevens betekent en hoe het kan worden van het toekomstig gebruik begint te ontstaan. Figuren 10A en 10B tonen hoe deze DNA-vingerafdrukken kunnen worden gebruikt om verschillende M. te onderscheiden leprae stammen tussen landen (10A) of zelfs tussen de families (10B). Familie en de gemeenschap gekoppeld gevallen is aangetoond dat M. dragen leprae van soortgelijke of identieke VNTR stam types. De hoop is dat het mogelijk is om meer inzicht te krijgen in de wijze (n) van lepra transmissie, zodat een systeem voor vroegtijdige opsporing van transmissienetwerken kan worden ontwikkeld voor die mensen most in gevaar, en dat curatieve therapie mag aanvangen voordat permanente neurologische en dermatologische schade wordt aangericht.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> DNeasy bloed en weefsel Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Primers </td><td> Verschillende </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosegel </td><td> Verschillende </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x of 6x Gel laadbuffer </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recepten beschikbaar om uw eigen te maken * </td></tr><tr><td> Ethidiumbromide oplossing </td><td> Verschillende </td><td></td><td> Verdunnen van de con. </td></tr><tr><td> Hi-Di Formamide Solution </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Uitrusting </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 2 Koelkasten </td><td> 4 ° C: 1 voor DNA-monsters, 1 voor primers en Multiplex reagentia </td></tr><tr><td> Een magnetron </td><td> Of geschikte manier voor het verwarmen van agarose en water om gels te maken </td></tr><tr><td> Een autoclaaf </td><td> Of snelkookpan voor het steriliseren van materialen </td></tr><tr><td> PCR-machine </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 sets van pipetten </td><td> 0,5 tot 10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ui 1 set voor de primers, een set voor DNA </td></tr><tr><td> Submarine gelelektroforese box </td><td> Met formulieren en kammen voor het bereiden van gels. </td></tr><tr><td> Elektroforese voeding </td><td> Met kabels voor aansluiting op gel box </td></tr><tr><td> Warmteblok </td><td> Voor Eppendorf buisjes </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Voor Eppendorf buizen / strips </td></tr><tr><td> Capillaire elektroforese-systeem (genetische analyse) </td><td> Of toegang tot een instelling die deze analyse kunnen uitvoeren </td></tr><tr><td> Kunststoffen </td><td> Wegwerp spuitbussen pipetpunten, Eppendorf buizen, acht-goed strips, 96-well platen, een aantal van optische kwaliteit </td></tr><tr><td> Computer met internetverbinding </td><td></td></tr></tbody></table>

dna-vingerafdrukken van mycobacterium leprae stammen met behulp van variabel aantal tandem repeat (vntr) - fragment lengte analyse (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

De studie van de overdracht van lepra is bijzonder moeilijk omdat de verwekker, Mycobacterium leprae, kan niet worden gekweekt in het laboratorium. De enige bron van de bacterie zijn lepra patiënten en experimenteel geïnfecteerde gordeldieren en naakt muizen. Dus veel van de methoden die worden gebruikt in de moderne epidemiologie zijn niet beschikbaar voor de studie van lepra. Ondanks een uitgebreide wereldwijde medicamenteuze behandeling voor lepra uitgevoerd door de WHO een, lepra nog steeds endemisch in veel landen met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen per jaar. 2 Het hele M. leprae genoom in kaart is gebracht 3,4 en vele loci zijn geïdentificeerd die segmenten van twee of meer basenparen herhaald (de zogenaamde micro-en minisatellieten). Klinische 5 stammen van M. leprae kunnen variëren in het aantal tandem herhaalde segmenten (short tandem repeats, STR) worden veel van deze loci. 5,6,7 variabel aantal tandem repeat (VNTR) 5 analyse is gebruikt om de verschillende stammen van de lepra bacillen te onderscheiden. Sommige van de loci lijken stabieler dan anderen, die minder variatie in aantallen te herhalen, terwijl anderen lijken soms sneller te veranderen, bij dezelfde patiënt. Terwijl de variabiliteit van bepaalde VNTRs heeft opgevoed vragen over hun geschiktheid voor stamtypering 7,8,9, de opkomende gegevens suggereren dat het analyseren van verschillende loci, die zijn divers in hun stabiliteit, kan gebruikt worden als een waardevol epidemiologisch instrument. Meerdere locus VNTR-analyse (MLVA) 10 is gebruikt om lepra evolutie en transmissie in een aantal landen, waaronder China 11,12, Malawi 8, de Filippijnen 10,13, 14 en Brazilië te bestuderen. MLVA omvat meerdere stappen. Eerst wordt bacterieel DNA geëxtraheerd samen met gastheerweefsel DNA van klinische biopsies of spleetogen huid vlekken (SSS). 10 De gewenste loci worden vervolgens geamplificeerd uit het geëxtraheerde DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescent-gelabelde primers 4-5 verschillende loci worden gebruikt per reactie, met 18 loci worden versterkt in een totaal vier reacties. 10 De PCR-producten kan worden onderworpen aan agarosegelelektroforese om de aanwezigheid van het gewenste DNA-segmenten te controleren, en vervolgens ingediend voor TL-fragment length analyse (FLA) met behulp van capillaire elektroforese. DNA van gordeldier gepasseerd bacteriën met een bekend aantal kopieën te herhalen voor elke locus wordt gebruikt als een positieve controle. De FLA chromatogrammen worden vervolgens onderzocht met behulp van Peak Scanner software en fragment lengte is omgezet naar het aantal VNTR exemplaren (allel). Ten slotte worden de VNTR haplotypes geanalyseerd voor patronen en wanneer het wordt gecombineerd met de patiënt klinische gegevens kunnen worden gebruikt om de verdeling van de stam types track.

Lepra, veroorzaakt door<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Is nog steeds endemisch in veel plaatsen. Om te weten te komen over de verspreiding en de wijze van overdracht van lepra, is het van belang te bepalen welke stam van<em&gt; M. leprae</em&gt; Heeft besmet een patiënt. Variabel aantal tandem repeats (VNTR) typering is een dergelijke werkwijze.

DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)

Het bestuderen van de transmissie van lepra is bijzonder moeilijk, aangezien het veroorzakende agens, Mycobacterium leprae, niet in het laboratorium gekweekt kan worden.

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een onderscheidende DNA-vingerafdruk van Mycobacterium leprae, de niet-kweekbare bacterie die lepra veroorzaakt, rechtstreeks uit klinische monsters. M. leprae bacterieel DNA, geëxtraheerd uit patiëntbiopten, wordt geamplificeerd via een multiplex PCR met gebruik van fluorescerende primers die specifiek zijn voor de variable number tandem repeat of VNTR loci. Zodra het DNA is geamplificeerd, wordt capillaire elektroforese uitgevoerd voor fragmentlengteanalyse.De gegevens worden geanalyseerd om het aantal korte tandem-repeat DNA-segmenten per locus te bepalen. Omdat verschillende stammen van EPRI een verschillend aantal tandem-repeats per locus vertonen, leveren gegevens van meerdere loci unieke DNA-vingerafdrukken op. Met deze techniek kan een database van de stamtypen van patiënten worden gegenereerd.De populatiestructuur, evolutie en transmissie van lepra tussen patiënten in gedefinieerde gemeenschappen en wereldwijd kunnen worden gekenmerkt, wat uiteindelijk genetische hulpmiddelen en bewijsmateriaal levert voor de eliminatie van lepra. Deze methode kan worden gebruikt voor het traceren van de verspreiding van lepra, het identificeren van clusters van recente infecties en risicogroepen, en het meten van de effectiviteit van beheersprogramma's. De procedure zal worden gedemonstreerd door Lee en Ron Jensen, onderzoekers uit mijn laboratorium, en Jason Rivers van onze instrument-kernfaciliteit. Extraheer DNA uit klinische biopsieën met behulp van een standaard KaiGen DNA-extractiekit.Zodra het DNA is verkregen, wordt er een nieuwe werkruimte ingericht in een schone PCR-kast. Om DNA-contaminatie te voorkomen, wordt de kast en een set pipetten afgeveegd met 70%ethanol en worden de kast en pipetten 15 minuten lang blootgesteld aan UV-licht. Zodra de kast schoon is, kan de multiplex PCR worden opgezet, waarbij voor elke multiplex PCR vier tot vijf primerparen worden gebruikt waarvan één primer per paar fluorescent is gelabeld.Moet gemengd worden. Gebruik 10 micromolaire primer-stocks bereid in TE-buffer om de primermengsels te maken; meng gelijke hoeveelheden van alle forward- of bovenste primers in een Eppendorf-buisje om een uiteindelijke concentratie van twee micromolair te bereiken. Voeg voor elke primer indien nodig TE-buffer toe.Meng op dezelfde wijze alle reverse- of lower-primers in een andere buis. Zodra de primer-mengsels zijn bereid, stelt u de PCR MES-mix samen. Maak een plaatoverzicht waarop alle monsters en controles per monster zijn aangegeven.De mastermix moet 12 µL KaiGen multiplex PCR mix, twee µL van elke primerpool en twee µL Q-oplossing bevatten. Zorg ervoor dat er voldoende mastermix wordt gemaakt om ook de controles op te nemen en om rekening te houden met pipetteerverliezen. Centrifugeer de mastermix kortstondig.Breng vervolgens 18 µL van de mastermix aan in elke put van een PCR-plaat. Om contaminatie van de DNA-monsters te voorkomen, dient u de handschoenen te wisselen en een aparte veiligheidskast af te nemen en te desinfecteren. Zoals eerder gedaan, plaatst u de plaat in deze kast zodra de zuiveringskap is gedesinfecteerd.Voeg vervolgens twee µL DNA-monster toe aan elke put met mastermix. Gebruik altijd pipetpunten met aerosolfilter om kruiscontaminatie te voorkomen. Sluit de PCR-platen zorgvuldig af en centrifugeer kort om de inhoud te mengen.Plaats vervolgens de reactieplaat in de thermocycler en start het PCR-programma voor het indienen van monsters. Bereid voor FLA de formamide-grootte en de mastermix voor, en voeg de verdunde PCR-producten toe in een schone eppendorf-tube: combineer per te testen monster 12 µL hoge formamide-oplossing en 0,3 µL GeneScan 500 LIZ sizing standard. Pipetteer 12,3 µL van deze oplossing per well in een 96-well reactieplaat van optische kwaliteit.Zodra de PCR is voltooid, wordt de plaat gecentrifugeerd. Zorg ervoor dat de positie van elk monster wordt genoteerd op de platenkaart. Aliquoteer vervolgens in een aparte 96-wells plaat 59 µL nucleasevrij water per well en voeg één µL van elke PCR-reactie per well toe om het geamplificeerde DNA in een verhouding van 1:60 te verdunnen.Zodra het DNA is verdund, gebruikt u een multichannelpipet om één microliter van elk verdund PCR-monster over te brengen naar de overeenkomstige put van de plaat die de formamide-losse oplossing bevat. Zodra het programma is voltooid, kunnen de monsters worden getest via standaard agarosegelelektroforese om te bevestigen dat de DNA-fragmenten van de voorspelde grootte zijn geamplificeerd. De monsters worden voorbereid voor analyse via fluorescente capillaire elektroforese met behulp van een FLA-genetische analyzer; voeg vóór de analyse een septum toe aan de plaat en centrifugeer kort om luchtbellen te verwijderen en het monster in de put te drukken.De IDE zal de strengen chemisch denatureren, waardoor hitte-denaturatie niet nodig is. Plaats de plaat in een laadbak. Evalueer het gelabelde PCR-product met capillaire elektroforese, zoals de genetische analyzer 31 30 xl van ABBI.Analyseer de monsters met behulp van een capillair van 50 centimeter, gevuld met POP-7 polymeer als scheidingsmedium. Het DNA migreert naar het uiteinde van het capillair, waar een laser en detector de fluorescerende labels meten. Open de verzamelsoftware van de analyzer. De analyzer moet voorafgaand aan het analyseren van de monsters worden gekalibreerd om alle gebruikte kleurstoffen te detecteren, inclusief de groottestandaard. De Dset die voor deze monsters is gebruikt, is ABI's G5. De monsters worden elektrokinetisch geïnjecteerd bij 1,6 kilovolt gedurende 15 seconden.Scheid de fragmenten door 15 kilovolt gedurende 1800 seconden toe te passen. De totale looptijd voor elke run is ongeveer 45 minuten. Zodra de run is voltooid, maakt u gegevensbestanden aan voor elk monster.De bestanden worden door de verzamelsoftware van de analyzer in een plaatmap op een vooraf bepaalde locatie geplaatst. De bestanden zijn in FSA-formaat. FLA-gegevens kunnen worden geanalyseerd met peak scanner-software, die gratis beschikbaar is op de website van Applied Biosystems.Klik om gegevens te analyseren op start new project en vervolgens op add files. Laad de geselecteerde gegevensbestanden in het programma, inclusief de positieve en negatieve controles. Selecteer en analyseer de geladen bestanden.De resultaten worden weergegeven als een FLA-chromatogram. De groottestandaarden verschijnen als oranje pieken, terwijl de gekleurde pieken de bacteriële DNA-monsters vertegenwoordigen voor elke geanalyseerde locus in het monster; klik op een piek om de grootte in baseparen te bepalen. Vanwege slip-strand-synthese door DNA-polymerase zal er voor sommige microsatellietloci een familie van pieken van dezelfde kleur worden gedetecteerd.In deze gevallen is de geselecteerde piek gewoonlijk die met de grootste amplitude. Vergelijk de fragmentgroottes in elk monster met de grootte van de positieve controle om te bepalen hoeveel tandem-repeatsegmenten aanwezig zijn voor elk getest allel en noteer de gegevens in een Excel-spreadsheet voor verdere analyse. In deze figuur worden de DNA-vingerafdrukken getoond van isolaten van zeven patiënten behorend tot drie verschillende families uit hetzelfde dorp, waarbij het aantal tandem-repeats voor elke geanalyseerde polymorfe locus wordt aangegeven.Deze gegevens suggereren dat twee leden van familie B zijn geïnfecteerd met dezelfde stam, terwijl één lid is geïnfecteerd met een afwijkende stam. Leden van familie C zijn waarschijnlijk geïnfecteerd met dezelfde stam. Dit geldt ook voor de leden van familie A. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u routinematig multiplex PCR en fragmentlengteanalyse kunt inzetten om V-N-T-R-D-N-A-vingerafdrukken te verkrijgen voor lepra-patiënten die zich melden in klinieken.Dit zijn nieuwe moleculaire instrumenten ter aanvulling op de conventionele epidemiologie voor de bestrijding van lepra.

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wij presenteren een niet-invasieve sampling aanpak voor een efficiënte haarmonsters te verzamelen van ongrijpbare kleine zoogdieren, zoals te zien voor de Amerikaanse pika. Tonen we het nut van deze methode door extractie DNA van bemonsterd haar en versterken van verschillende soorten van moleculaire merkers vaak gebruikt in studies van wilde dieren ecologie en natuurbehoud.

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Source: Gulla, S., et al. Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the procedure for separating fluorescently labeled variable number tandem repeat (VNTR) amplicons, derived from a fish-pathogenic bacterium, using capillary electrophoresis to generate size-specific electropherogram profiles for bacterial identification.

Detection of Fish Pathogens Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis

Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.

Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

De multi-Locus variabele-aantal tandem-repeat analyse (MLVA) assay hier gepresenteerd maakt goedkope, robuuste en draagbare hoge-resolutie genotypering van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri. Beginnend bij zuivere culturen, gebruikt de assay multiplex PCR en capillaire elektroforese om tien-loci MLVA-profielen voor downstreamtoepassingen te produceren.

Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om DNA-vingerafdrukkenprofielen te genereren door de VNTR-locus D1S80 te versterken uit epitheelcel-DNA.

Toepassing van DNA-vingerafdrukken met behulp van de D1S80 Locus in labklassen

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

In deze studie werd een dot-blot-applicatie ontworpen om Leptospira te detecteren van de drie belangrijkste clades in watermonsters. Deze methode maakt de identificatie mogelijk van minimale DNA-hoeveelheden die specifiek het doelwit zijn van een digoxigenine-gelabelde sonde, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door een anti-digoxigenine-antilichaam. Deze aanpak is een waardevol en bevredigend instrument voor screeningsdoeleinden.

Polymerasekettingreactie en dot-blot-hybridisatie voor leptospira-detectie in watermonsters

Leer DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae met VNTR-typering en fragmentlengteanalyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het traceren van lepraoverdracht en het identificeren van risicogroepen.

DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA) (Video) | JoVE Journal

DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)

Meer video's verkennen