Replating Differentiated Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:20 min • July 8th, 2025
Start with a large culture plate containing human pluripotent stem cell-derived differentiated neurons with a dense neuronal network.
Incubate these neurons with mild proteolytic enzymes to detach them from the plate, lifting them as a sheet.
With continued incubation, enzymes partially disrupt the cell connections, loosening the neuronal networks.
Add a culture medium to stop the enzyme activity.
Repeatedly pipette the detached neurons to separate them from each other.
Filter the neurons through a cell strainer to remove cell clumps and collect the individual neurons.
Centrifuge and remove the supernatant. Resuspend them in a growth medium.
For replating, seed these neurons onto a polymer and an adhesion protein-coated multi-well plate. Incubate to allow their attachment.
Neurons utilize nutrients from the medium to remain viable. Replace the culture medium regularly to maintain nutrient levels.
Incubate further to allow neuronal maturation and formation of connections between them.
Start by gently rinsing the plate of differentiated neurons with PBS. Disperse the PBS down the wall of the plate, and not directly onto the cells to avoid disrupting them. Aspirate the PBS from the edge of the dish while tipping it, taking care not to touch the cells.
Apply at least 1 milliliter of proteolytic enzyme per 10-centimeter plate, and return the cells to the incubator for 40 to 45 minutes. During the incubation, check neurons on a phase-contrast microscope, and continue the protease treatment until the neural network completely detaches from the plate and starts to break apart. When the neurons have detached, stop digestion by adding 5 milliliters of fresh DMEM media for every 1 milliliter of protease.
Use a serological pipette to gently triturate the cells against the plate 5 to 8 times, making sure to not apply too much pressure. Strain the cells through a 100-micrometer mesh into a 50-milliliter conical tube drop-by-drop, and rinse the strainer with an additional 5 milliliters of fresh DMEM media.
Use a benchtop centrifuge to spin the cells down at 1,000 times g for 5 minutes. After centrifugation, return the conical tube to the biosafety cabinet and aspirate most of the media, leaving 250 microliters to keep the cells moist. Gently resuspend the cells in 2 milliliters of fresh DMEM media, and pass them through the end of a 5-milliliter serological pipette.
Finally, invert the tube 2 to three times. Use a hemocytometer and trypan blue to count the viable cells, and then dilute the cells with fresh DMEM to the desired concentration. Add appropriate supplements to the tube depending on the requirements of the specific cell line, and gently mix the cells by tilting the conical tube 2 to 3 times.
Aspirate laminin coating from a 24-well plate and rinse it once with PBS. Aspirate the PBS and apply cell solution to each well in a figure-eight motion to avoid clumping. When finished plating the cells, return the plate to the incubator set at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het losmaken en opnieuw uitplaten van gedifferentieerde neuronen afgeleid van humane pluripotente stamcellen. De methode maakt gebruik van proteolytische enzymen om neuronen te scheiden, terwijl hun levensvatbaarheid behouden blijft voor verder experimenteel onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celkweek
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Humane pluripotente stamcellen kunnen differentiëren tot neuronen.
- Het in stand houden van neuronale netwerken is cruciaal voor het bestuderen van neuronaal gedrag.
- Proteolytische enzymen kunnen het losmaken van neuronen van cultuurplaten vergemakkelijken.
- Een juiste behandeling is essentieel om de celviabiliteit te behouden.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het losmaken en opnieuw uitplaten van neuronen.
- Om de instandhouding van de neuronale gezondheid tijdens het proces te waarborgen.
- Om verdere studies naar neuronale verbindingen en gedrag te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Incubatie van neuronen met proteolytische enzymen.
- Pipetteren om individuele neuronen te scheiden.
- Filtreren door een celzeef om klonten te verwijderen.
- Opnieuw uitplaten op gecoate multi-well platen voor verdere incubatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle loskoppeling van neuronen zonder significant verlies van levensvatbaarheid.
- Neuronen waren in staat om te hechten en te rijpen op nieuwe substraten.
- Het protocol maakt een efficiënte hantering van neuronale culturen mogelijk.
- Het handhaven van nutriëntenniveaus was cruciaal voor de gezondheid van de cellen.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het losmaken en opnieuw uitplaten van neuronen.
- Voorzichtige hantering tijdens het proces is essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen.
- Dit protocol kan worden toegepast in diverse contexten van neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het opnieuw uitplaten van gedifferentieerde neuronen afgeleid van humane pluripotente stamcellen maakt schaalbare high-content screening van neuronale rijping en connectiviteit mogelijk. Deze workflow ondersteunt vroege ontdekking en doelwitvalidatie door een robuust, reproduceerbaar systeem te bieden voor het onderzoeken van neuronale fenotypes. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in neurobiologie-georiënteerde portfolio's door de preparatie van neuronen voor downstream assays te standaardiseren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Faciliteert het onderzoek naar neuronale differentiatie en synaptische rijping in mens-relevante systemen.
- Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door kwantitatieve analyse van neuritogenese en connectiviteit te ondersteunen.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van modellen voor neurodevelopmentele en neurodegeneratieve aandoeningen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt uniforme neuronale culturen voor voor high-content screeningplatforms.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door het standaardiseren van de stappen voor het losmaken en opnieuw uitplaten van neuronen.
- Maakt kwantitatieve meting van neurietuitgroei en synapsvorming mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare evaluatie van verbindingen in multi-well formats.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt in vitro neuronale modellen uit met ziekterelateerde fenotypen voor translationeel onderzoek.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van de neuronale functie.
- Vermindert mechanistische ambiguïteit in neurofarmacologische pipelines.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar prekliniek door gestandaardiseerde preparatie van menselijke neuronen mogelijk te maken voor fenotypische screening en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot neuronale differentiatie en synaptische connectiviteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor neuriet- en synaps-assays.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van neuronale fenotypes over verschillende experimentele condities mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen van neurologische aandoeningen.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbare workflow voor diverse neurobiologische onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert de biologische variabiliteit in neuronale assays.
- Operationele waarde: Standaardiseert de neuronale preparatie voor high-throughput en multi-site studies.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen voor portfolio's met neuroactieve verbindingen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurobiologische assets mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek en neuronale differentiatie.
- Toegang tot celkweekinfrastructuur en high-content imaging-platforms is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor protocollen met betrekking tot detachering, heruitplating en assays.
- Aanpassing kan noodzakelijk zijn voor verschillende stamcellijnen of neuronale subtypen.
- De celviabiliteit en rijping zijn afhankelijk van nauwkeurige hantering en het onderhoud van het medium.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Goud nanorod-bijgestaan Optische Stimulatie van neuronale cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Human Induced Pluripotent Stem Cells into Neurons on Micro-Electrode Arrays
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026