Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:03 min • July 8th, 2025
Take mouse embryonic stem cells suspended in serum-free media containing small molecule inhibitors.
Seed the cells on a non-adherent culture plate, allowing them to proliferate and aggregate to form three-dimensional embryoid bodies or EBs.
Additionally, the inhibitors block non-neuronal signaling pathways and induce embryonic stem cell differentiation toward a cortical neural fate.
Transfer the EBs to a tube, centrifuge, and remove the supernatant.
Resuspend the EBs in a solution containing an enzyme cocktail and DNase.
The enzymes dissociate the EBs into single cells, while DNase degrades contaminating DNA.
Add serum-free media containing inhibitors to stop the enzymatic activity, then centrifuge and remove the supernatant containing enzymes.
Resuspend the cells in media containing small molecule inhibitors and transfer them onto culture plates coated with adhesion factors.
The cells attach to the coated plate surface.
The inhibitors prevent apoptotic cell death and induce cellular differentiation into cortical interneuron progenitors.
Start growing the cells as embryoid bodies by adding 75,000 cells per milliliter in KSRN2 media in the non-adherent tissue culture dishes and incubate them at 37 degrees Celsius. On DD1, prepare for cell landing by coating the tissue culture-treated dishes with poly-L-lysine for at least one hour or overnight at 37 degrees Celsius.
On DD2, aspirate the poly-L-lysine and coat the plates with laminin overnight at 37 degrees Celsius. On DD3, before beginning EB dissociation, aspirate laminin, and allow the plates to completely dry in a tissue culture hood.
Afterward, transfer the EBs with the media into a 15-milliliter tube and centrifuge for three to four minutes at 15 times g or until the EBs have pelleted. Aspirate the media and add 3 milliliters of cell detachment solution containing DNase. Then, incubate the sample at 37 degrees Celsius for 15 minutes.
Gently flick the tube every three minutes to aid in EB dissociation. Once the EBs are no longer visible or 15 minutes have elapsed, add 6 milliliters of KSRN2 containing DNase and centrifuge for five minutes at 200 times g. Then, plate the cells in KSRN2 containing LDN193189, XAV939, and the ROCK inhibitor Y27632 at 4.5 to 5 x 104 cells per centimeter squared.
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het differentiëren van embryonale stamcellen van muizen tot corticale interneuron-progenitoren met behulp van kleine molecule-remmers. Het proces omvat de vorming van embryonale lichaampjes (EBs) en de daaropvolgende dissociatie tot enkelvoudige cellen voor kweek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- embryonale stamcellen van muizen kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Small molecule-remmers kunnen signaalpaden tijdens de differentiatie beïnvloeden.
- Corticale interneuronen spelen een cruciale rol in de hersenfunctie.
- Embryoïde lichaampjes bieden een driedimensionale kweekomgeving.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het genereren van corticale interneuron-progenitoren uit embryonale stamcellen.
- Het onderzoeken van de effecten van kleine molecuulremmers op celdifferentiatie.
- Het optimaliseren van de kweekcondities voor celhechting en groei.
Gebruikte methoden
- Embryonale stamcellen werden gekweekt in serumvrij medium met inhibitoren.
- Cellen werden gezaaid op niet-adherente platen om EB's te vormen.
- EB's werden gedissocieerd tot enkelvoudige cellen met behulp van een enzymcocktail en DNase.
- Cellen werden geplaatst op platen gecoat met adhesiefactoren voor differentiatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van EB's uit embryonale stamcellen.
- Efficiënte dissociatie van EB's tot levensvatbare enkelcellen.
- Cellen gedifferentieerd tot corticale interneuron-progenitoren.
- Remmers voorkwamen celdood en bevorderden differentiatie.
Conclusies
- Het protocol genereert effectief corticale interneuroon-progenitoren uit embryonale stamcellen.
- Small molecule-remmers zijn cruciaal voor het bevorderen van de differentiatie.
- Deze methode kan worden toegepast om de ontwikkeling van corticale neuronen te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt de schaalbare generatie van corticale interneuronen-precursoren uit embryonale stamcellen van muizen mogelijk, wat een ziekte-relevant systeem biedt voor het bestuderen van dysfunctie van inhiberende neuronen bij neuropsychiatrische aandoeningen. Door gedefinieerde kleine molecuulremmers te gebruiken om de differentiatie te sturen, ondersteunt deze aanpak het mechanistische de-risking van therapeutische targets die betrokken zijn bij de vorming en functie van corticale circuits. Het protocol levert een reproduceerbaar, kwantitatief cellulair model op dat geschikt is voor targetvalidatie en fenotypische screening in vroege discovery-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot de ontwikkeling en functie van corticale interneuronen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van ziekterelateerde neurale progenitorcellen voor studies naar target engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de biologie van menselijke corticale interneuronen te modelleren in een gecontroleerd in vitro systeem.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gestandaardiseerde corticale interneuroon-precursoren die geschikt zijn voor compound-screening en assays voor padmodulatie.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van differentiëringsefficiëntie, marker-expressie en elektrofysiologische rijping mogelijk als afhankelijke variabelen.
- Schaalbaarheid: De expansie op basis van embryoïde lichaampjes maakt de productie van voldoende celgetallen mogelijk voor high-content screening-formaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Precursoren van corticale interneuronen dienen als model voor neuro-ontwikkelingsstoornissen en psychiatrische aandoeningen waarbij GABAerge dysfunctie een rol speelt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen uit stamcellen afgeleide modellen en de preklinische validatie van targets die de neuronale migratie en integratie reguleren.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt de pathway-specifieke effecten van kleine moleculen op de specificatie van het neuronale lot en de rijping.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking en ondersteunt de validatie van targets door de generatie van een gedefinieerd neuronaal celtype voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische efficiëntietests.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten op genen en signaalpaden die de specificatie en overleving van corticale interneuronen regelen.
- Screening: Produceert gedifferentieerde cellen met een consistente markerexpressie voor betrouwbare compound-screening en read-outs van targetmodulatie.
- Analytica: Maakt kwantitatieve beoordeling van differentiatie-efficiëntie, progenitoropbrengst en inhibitorpotentie mogelijk als cruciale beslissingsmetrieken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling door een mens-relevant systeem te bieden om targeteffecten op de ontwikkeling van inhiberende neuronen te evalueren.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het gedefinieerde differentiatieprotocol kan worden gestandaardiseerd over teams en worden aangepast voor andere neuronale subtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door mechanisch inzicht in de differentiatiepaden van corticale interneuronen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de productie van neurale precursors voor herhaalde screeningscampagnes.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid bij de validatie van neuropsychiatrische targets te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van effecten in een ziekterelevant neuronaal systeem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, neurale differentiatie en het omgaan met kleine moleculen.
- Afhankelijk van toegang tot niet-adherente kweekplaten, reagentia voor enzymatische dissociatie en adhesie-gecoate substraten.
- Vereist gestandaardiseerde inhibitorconcentraties en timing over verschillende batches voor reproduceerbare differentiatie.
- Aanpassing aan humane stamcellen of alternatieve neuronale lijnen kan optimalisatie van inhibitorcombinaties vereisen.
- Beperkt door de murine oorsprong van de cellen, wat validatie in humane modellen kan vereisen voor translationeel vertrouwen.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026