A Method for 3D Bioprinting Murine Cortical Astrocytes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:13 min • July 8th, 2025
Take an astrocyte suspension.
Add a bioink solution containing gelatin, photocrosslinkable gelatin derivatives, photoinitiators, fibrinogen, and laminin.
Transfer the suspension to a syringe with a blunt needle.
Chill the syringe for bioink gelling. Connect the syringe to the bioprinter's printhead.
Position the needle appropriately to the culture plate. Initiate bioprinting with set parameters and the design.
Astrocyte-containing bioink is pushed out of the needle, and is deposited in layers onto the plate, forming a three-dimensional structure with trapped astrocytes.
Expose the bioprinted construct to ultraviolet light. The photoinitiator aids in gelatin derivative crosslinking, enhancing bioconstruct stability.
Treat with thrombin and calcium ions.
Thrombin, with calcium ions, converts fibrinogen into fibrin, assembling into a stable 3D biopolymer network.
Discard the solution and wash with buffer to remove the crosslinking agents.
Add astrocyte media and incubate. Laminin aids astrocyte adhesion and spreading, forming a 3D neural-like tissue rich in astrocytes.
To obtain a final concentration of 1 x 106 cells per milliliter, transfer 1 milliliter of gelatin-gelatin-methacryloyl-fibrinogen solution to the tube containing the cells, and homogenize by gently pipetting up and down. Use a 1000-microliter pipette to slowly transfer the astrocytes laid in gelatin-gelatin-methacryloyl-fibrinogen bioink solution to a 5-milliliter plastic syringe, avoiding bubble formation. Connect a sterile 22-gauge blunt needle to the syringe.
Expose the bioprinter to UV light for 15 minutes, and then wipe the bioprinter with 70% ethanol. Then connect the syringe to the bioprinter print head, and manually flush the bioink to remove the remaining bubbles.
To conduct bioprinting, place a 35-millimeter culture dish on the bioprinter table. Position the needle 0.1 millimeters away from the culture dish surface to allow movement of the needle, and press the Print button. Once the bioprinting is over, ensure that the syringe moves away from the dish, and close the culture dish. Place the culture dish under UV light for gelatin-methacryloyl cross-linking.
Use a sterile spatula to transfer the bioprinted construct to a 24-well plate, add 500 microliters of thrombin calcium chloride solution, and leave for 30 minutes to allow fibrin cross-linking. After removing the cross-linking solution, wash the construct with 2 milliliters of PBS. Then, replace the PBS with 1 milliliter of astrocyte culture medium. Incubate at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide, and change the medium every three days.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail een methode voor het bioprinten van astrocyten met behulp van een bio-inkt op basis van gelatine. Het proces omvat het creëren van een driedimensionale structuur die de adhesie en groei van astrocyten ondersteunt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Bioprinten
- Tissue Engineering
Achtergrond
- Astrocyten spelen een cruciale rol in de functie van neuraal weefsel.
- Bioprinttechnieken kunnen complexe weefselstructuren creëren.
- Gelatine en fibrinogeen worden veelvuldig gebruikt in bio-inktformuleringen.
- Crosslinking-middelen verbeteren de stabiliteit van gebioprinte constructen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het bioprinten van astrocyten.
- Het onderzoeken van de effecten van de bio-inktsamenstelling op het gedrag van astrocyten.
- Het creëren van een 3D neuraal-achtig weefsel voor onderzoeks- en therapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een bio-inktoplossing met gelatine en fibrinogeen.
- Gebruik van een bioprinter voor het deposeren van bio-inkt met astrocyten.
- Toepassing van UV-licht voor de crosslinking van gelatinederivaten.
- Incubatie van de gebioprinte constructen in astrocytenmedium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van een stabiele 3D-structuur met astrocyten.
- Verbeterde adhesie en spreiding van astrocyten door laminine.
- Effectieve crosslinking van de bio-inkt, wat leidt tot structurele integriteit.
- Vestiging van een levensvatbaar culturesysteem voor astrocyten.
Conclusies
- De bioprintmethode ondersteunt de groei van astrocyten effectief.
- De samenstelling van de bio-inkt heeft een aanzienlijke invloed op de weefselvorming.
- Deze benadering kan worden gebruikt voor het creëren van neurale weefselmodellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
3D-bioprinting van astrocyten maakt de creatie mogelijk van fysiologisch relevante neurale weefselmodellen voor targetvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel (CZS). Deze benadering verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door een reproduceerbaar, menselijk relevant systeem te bieden om astrocyten-gemedieerde pathways en neuro-inflammatoire mechanismen te onderzoeken. Het pakt een cruciaal knelpunt in het ontdekkingsproces aan, waarbij inadequate gliale modellering leidt tot translationele mislukkingen bij neurodegeneratieve en neuropsychiatrische indicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om astrocyten-specifieke therapeutische hypothesen te onderzoeken in een 3D-context die de natuurlijke corticale architectuur weerspiegelt.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor functionele targetvalidatie met behulp van primaire muizenastrocyten in een instelbare micro-omgeving.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het modelleren van glia-neuronale interacties die cruciaal zijn voor target-engagement in het CZS en de veiligheidsbeoordeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare neurale-achtige weefseloutputs die geschikt zijn voor high-content imaging en fenotypische screening van modulatoren die de adhesie, spreiding of netwerkvorming van astrocyten beïnvloeden.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare biogeprinte constructen met gedefinieerde crosslinking-kinetiek, wat standaardisatie van assays tussen discovery-teams mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt multi-well plate-formaten voor dosis-responsprofielen en screening van compound-bibliotheken in CNS-programma's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug van de fundamentele astrocytenbiologie naar preklinische validatie door fenotypische getrouwheid te behouden in een 3D neuraal-achtig weefsel.
- Ziekterelevante Systeem: Maakt modellering van astrocytose en reactieve gliose in de context van neurodegeneratieve ziekten mogelijk wanneer aangevuld met pathologische stimuli.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroege read-outs te bieden over de effecten van verbindingen op astrocyten-gemedieerde neurotoxiciteit of neuroprotectie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het continuüm van CNS-ontdekking, van vroege hypothesetests voor targets tot lead-optimalisatie, en biedt een biologisch risicovrije tussenstap voorafgaand aan in vivo validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en targetvalidatie door gecontroleerde manipulatie van astrocyten-matrixinteracties in een 3D-formaat mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-ready constructen met kwantitatieve outputs over celspreiding, netwerkintegriteit en biomarkerexpressie voor het screenen van verbindingen.
- Analytics: Maakt de meting van afhankelijke variabelen mogelijk, zoals astrocytenmorfologie, proliferatie en markerexpressie (bijv. GFAP, S100β), om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft de fenotypische relevantie van de ontdekkingsfase tot en met de preklinische stadia door de functionaliteit van astrocyten in een biomimetische niche te behouden.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een platformcapaciteit die toepasbaar is op meerdere CNS-targets en modaliteiten, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in CNS-doelwitmodellen door de afhankelijkheid van 2D-monoculturen, die de gliale complexiteit niet vatten, te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde bioink-formulering, crosslinking-protocollen en gedefinieerde kweekcondities.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van gliaal-gemedieerde risico's mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium bij neurodegeneratieve programma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-kandidaten op basis van effecten in een fysiologisch relevant weefselmodel dat astrocyten bevat.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire cellen, het bedienen van een bioprinter en technieken voor foto- en enzymatische crosslinking.
- Afhankelijk van toegang tot een bioprinter met UV-crosslinkingmogelijkheden en een steriele infrastructuur voor de verwerking van hydrogels.
- Vereist cross-team standaardisatie van de bio-inktpreparatie, printparameters en protocollen voor rijping na het printen.
- Aanpassing aan menselijke iPSC-afgeleide astrocyten of cellen uit ziektemodellen vereist validatie van de biocompatibiliteit en functionele rijping.
- Praktische beperkingen omvatten batch-tot-batch variabiliteit in bio-inktcomponenten en de noodzaak voor optimalisatie van de crosslinkingduur om de stabiliteit van het construct in balans te brengen met de celviabiliteit.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Astrocyte Isolation: A Method to Obtain Pure Preparation of Mouse Cortical Astrocytes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vitro Method to Generate Astrocyte Scaffolds within Hydrogel Micro-columns
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026