Dissociating and Culturing Neurons from Hippocampal Tissue Samples
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:35 min • July 8th, 2025
Start with hippocampal tissue samples containing neurons and various non-neuronal cells.
Add a protease enzyme solution. The enzyme degrades the tissue’s extracellular matrix, initiating cell dissociation.
Wash with a plating medium to remove residual enzymes.
Pipette the digested tissue repeatedly to mechanically dissociate the cells from the tissue, forming a single-cell suspension.
Centrifuge and remove the supernatant. Resuspend the cells in the plating medium.
Seed the cells onto a poly-D-lysine-coated coverslip in a multi-well plate. Lysine enhances cell attachment.
Replace the plating medium with a neuron maintenance medium containing essential nutrients for neuron survival.
Refresh half of the media with maintenance media containing arabinosylcytosine, or Ara-C.
Ara-C enters the cells and selectively inhibits the growth of non-neuronal cells, leading to their death.
Replace the media with fresh maintenance media to support neuron survival.
To dissociate the hippocampal neurons for culture, thaw the protease enzyme solution, and pre-warm the plating medium at 37 degrees Celsius. Next, rinse the dissected hippocampus with SLDS. Then remove it, and add 2 milliliters of protease enzyme solution, and incubate the sample at 37 degrees Celsius for 15 minutes.
Afterward, wash the hippocampus explants with 5 to 10 milliliters of plating medium twice, and add 5 milliliters of plating medium. Dissociate the hippocampal explants into single cells by generating a small vortex using a pipette with a 1-milliliter plastic tip. Pipette up and down about 40 times, avoiding the formation of oxygen bubbles until the solution becomes cloudy and no large pieces of explant remain.
Next, centrifuge the cells at 1,125 times gravity for 3 minutes. Remove the supernatant with the cells submerged in medium, and resuspend the cells in 145 milliliters of plating medium. Then, add 1 milliliter of the cell suspension per well to a 24-well plate. Incubate the cells in the plating medium at 37 degrees Celsius for two to four hours.
Afterward, remove the plating medium and replace it with fresh maintenance medium. After two days, replace half of the medium with two micromolar Ara-C dissolved in maintenance medium to inhibit growth of fibroblasts, endothelial, and glial cells. Then, after exposing the cells to Ara-C for two days, replace the medium with fresh maintenance medium.
Overzicht
Dit artikel beschrijft in detail het proces voor het dissocieren van hippocampale neuronen uit weefselmonsters voor kweek. Er wordt een overzicht gegeven van de stappen die nodig zijn om de cellen voor te bereiden op onderhoud en groei in vitro.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celkweek
- Neuronale biologie
Achtergrond
- Hippocampale neuronen zijn essentieel voor het bestuderen van diverse neurologische functies.
- Cel-dissociatietechnieken zijn noodzakelijk om neuronen te isoleren van niet-neuronale cellen.
- Een correct onderhoud van neuronale culturen is cruciaal voor de experimentele nauwkeurigheid.
- Het gebruik van Ara-C helpt bij het selectief remmen van de groei van niet-neuronale cellen.
Doel van de studie
- Het bieden van een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van hippocampale neuronen.
- Het verdiepen van de kennis over technieken voor neuronale celkweek.
- Het verbeteren van de overleving en het onderhoud van gekweekte neuronen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hippocampusweefselmonsters.
- Gebruik van een protease-enzymoplossing voor weefseldissociatie.
- Mechanische dissociatie om een enkelcellige suspensie te verkrijgen.
- Toepassing van Ara-C om de groei van niet-neuronale cellen te remmen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle dissociatie van neuronen uit hippocampusweefsel.
- Effectieve instandhouding van neuronale culturen over een langere periode.
- Aangetoonde selectieve inhibitie van niet-neuronale cellen met behulp van Ara-C.
- Vestiging van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol maakt een efficiënte isolatie en kweek van hippocampale neuronen mogelijk.
- Het gebruik van Ara-C is essentieel voor het behoud van de neurale zuiverheid.
- Deze methodologie kan worden toegepast op diverse studies binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare dissociatie en cultuur van hippocampale neuronen maken de creatie mogelijk van gestandaardiseerde, neuron-verrijkte in vitro systemen voor vroege stadia van drug discovery in de neurowetenschappen. Deze culturen bieden een gecontroleerd platform voor het onderzoeken van neuronale mechanismen, wat bijdraagt aan het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en mechanistische risicoanalyse. De selectiviteit van de methode voor neuronale populaties verbetert de translationele continuïteit en de besluitvorming over portfolio's in pijplijnen gericht op neurobiologie.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt de isolatie van zuivere neuronale populaties mogelijk voor hypothesegestuurde studies.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door niet-neuronale storende variabelen te minimaliseren.
- Faciliteert functionele target-validatie in ziekterelateerde neuronale systemen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor vroege portfolio-triage.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt reproduceerbare neuronenculturen voor de standaardisatie van assays.
- Maakt kwantitatieve meting van neuronale responsen op verbindingen mogelijk.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform voor screeningcampagnes.
- Vermindert variabiliteit door interferentie van niet-neuronale cellen te beperken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro-modellen uit met ziekterelateerde neuronale biologie.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk op basis van neuron-specifieke gegevens.
- Faciliteert de exploratie van biomarkers in neuron-verrijkte systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor neuronale dissociatie en kweek bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en assay-ontwikkeling, en biedt fundamentele systemen voor downstream screening en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in neuron-specifieke contexten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve neuronale assays voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt meting van neuronale levensvatbaarheid en respons mogelijk, wat statistische vergelijking tussen condities ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Vormt een brug naar preklinische modellen door de neuronale zuiverheid en relevantie te behouden.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is voor diverse neurobiologische projecten.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in neuronale studies.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor neuronenculturen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste neuronale assays.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van neurobiologische assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van neuronaal weefsel en celkweektechnieken.
- Vereist toegang tot protease-enzymoplossingen, met poly-D-lysine gecoate platen en gecontroleerde incubatieomgevingen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbaarheid in studies op meerdere locaties.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende neuronale subtypes of species.
- Afhankelijk van de effectieve verwijdering van niet-neuronale cellen voor optimale assayprestaties.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Primaire Cultuur van hippocampale neuronen van P0 pasgeboren ratten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Obtaining Various Neural Cell Populations from a Rat Hippocampus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Sex Stratified neuronale kweken om ischemische Cell Death Pathways Studie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026