Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 4:00 min • July 8th, 2025
Take embryoid bodies, or EBs, derived from human induced pluripotent stem cells. These EBs are composed of three germ layers.
Transfer the EBs to a matrix-coated culture dish containing a suitable medium and incubate.
The matrix enables the EBs to attach to the culture dish.
The growth factors and nutrients in the medium facilitate the ectodermal cells of the EBs to form neuroepithelial aggregates arranged in a circular pattern termed a rosette.
Cut the rosette fragments and detach them from the dish.
Collect the fragments and spin them down.
Discard the supernatant and resuspend the fragments.
Using a pipette, move the fragments up and down to dissociate them.
Add the desired number of cells to a matrix-coated well plate containing a differentiation medium.
The components of the differentiation medium facilitate the neuroepithelial cells to transform into fully functional neuronal and glial cells, the primary cells of the nervous system.
On day two, aspirate standard matrix coating solution from a previously prepared 60-milliliter dish, and add 5 milliliters of complete neuroepithelial induction medium or NRI to the dish. Working under the stereoscopic microscope at 4x magnification, and using a 200-microliter pipette, collect around 50 floating embryoid bodies and transfer to one coated dish. Then, incubate the dish at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide.
The next day, day three of the differentiation procedure, check the dish under the microscope at 10x magnification to ensure that the embryoid bodies are all attached. Then, gently perform a total medium change with complete NRI medium. Change the NRI medium every other day up to day seven when rosette-like neuroepithelial aggregates should be visible.
On day seven, coat a 96-well plate by pipetting 100 microliters of standard matrix diluted in culture medium into each well. On day eight, cut the rosette-like aggregates into fragments under a stereoscopic microscope at 10x magnification in sterile conditions.
Note that the rosettes tend to easily detach from the dish when touched with the needle. In this case, partially disaggregate the detached rosette with the needle tip. If the rosettes will remain partially attached, use a 200-microliter pipette to complete the detachment of the rosette fragments.
Rosette cuttings require good manual skills and precision in order to avoid cutting non-neuroectodermal derivatives.
Next, collect the rosette fragments and their medium into a 15-milliliter conical tube. Rinse the dish with 2 milliliters of NRI medium to recover all fragments. Then, spin down the rosette fragments at 112 times g for one or two minutes.
After aspirating the supernatant, gently resuspend the pellet in 1 milliliter of pre-warmed 1x DPBS without calcium and magnesium. Gently pipette the rosette fragments up and down to partially dissociate them. Then, add 4 milliliters of complete NRI medium and count the cells using trypan blue and an automated cell counter.
Next, aspirate the standard matrix coating solution from the 96-well plate, and deposit the cells into the wells at a density of around about 15,000 cells per square centimeter in NRI medium. Incubate the plate overnight at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide. On day 10, perform a total medium change using complete neuronal differentiation medium.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen naar neuronale en gliale cellen met behulp van embryonale lichamen (EBs). Het proces omvat het kweken van EBs in een met matrix gecoate schaal en het gebruik van een neuro-epitheliaal inductiemedium om de celdifferentiatie te faciliteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Celldifferentiatie
Achtergrond
- Embryoïde lichamen zijn afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen.
- Ze bestaan uit drie kiemblaadjes, die kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Neuro-epitheliale aggregaten vormen zich tijdens het differentiatieproces.
- Juiste kweekcondities zijn essentieel voor een succesvolle differentiatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het genereren van neuronale en gliale cellen uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen.
- Om de condities voor de vorming van neuroepitheliale aggregaten te optimaliseren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Kweek van embryoïde lichamen in met matrix gecoate schaaltjes.
- Gebruik van neuro-epitheliaal inductiemedium voor differentiatie.
- Microscopisch onderzoek om celhechting en groei te monitoren.
- Celtelling en bepaling van de levensvatbaarheid met trypaanblauw.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van rozetachtige neuro-epithele aggregaten tegen dag zeven.
- Efficiënte differentiatie tot neuronale en gliale cellen tegen dag tien.
- Het protocol demonstreert reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid voor de generatie van cellen.
- Celviabiliteit en functionaliteit bevestigd via standaardassays.
Conclusies
- Het beschreven protocol is effectief voor het differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen naar neurale lijnen.
- Geoptimaliseerde kweekcondities zijn essentieel voor een succesvolle differentiatie.
- Deze methode kan worden gebruikt voor verder onderzoek in de neurowetenschappen en regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Dit protocol maakt de schaalbare generatie van menselijke neuronale en gliale cellen uit iPSCs mogelijk, waardoor een ziekterelatief in vitro systeem wordt geboden voor neurotoxiciteitsscreening en de beoordeling van mechanistische pathways. Door gemengde neurale culturen te produceren die belangrijke aspecten van de biologie van het menselijke zenuwstelsel nabootsen, ondersteunt deze methode targetvalidatie in een vroeg stadium en de evaluatie van lead-compounds in programma's voor neurodegeneratieve ziekten. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij preklinische veiligheidstests door de afhankelijkheid van diermodellen te verminderen en de translationele relevantie te verbeteren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in neurale cellen van menselijke oorsprong die neuronale en gliale markers tot expressie brengen.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van fysiologisch relevante cellen voor studies naar het verminderen van risico's in signaalpaden en target engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van effecten van verbindingen op neurogene en gliogene differentiatieprocessen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde neuronaal-gliale coculturen die geschikt zijn voor gemultiplexte toxiciteits- en signaleringsassays.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de reproduceerbaarheid van assays door gedefinieerde differentiatie-tijdlijnen en kwantificeerbare eindpunten zoals rozetvorming en celopbrengst.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 96-wells formaten voor compound-screening met gemiddelde doorvoer.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Maakt gebruik van menselijke iPSC-afgeleide cellen om de cross-species voorspelbaarheid van de effecten van neuroactieve verbindingen te verbeteren.
- Mechanische risicoreductie: Maakt monitoring mogelijk van specifieke neuro-ontwikkelingspaden die door toxicanten worden verstoord.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt de progressie van hit-identificatie naar lead-optimalisatie met behulp van consistente cellulaire modellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking, waardoor het testen van doelhypothesen in menselijke neurale systemen mogelijk is voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische werkzaamheidsstudies.
- Discovery Biology: Ondersteunt functionele validatie van neurodevelopmentale targets via gerichte differentiatie en marker-expressieanalyse.
- Screening: Levert assay-klare neuronale en gliale cellen met kwantificeerbare outputs voor screening van compound-bibliotheken.
- Analytics: Maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van differentiatie-efficiëntie, celviabiliteit en lineage-specifieke marker-expressie.
- Translationeel onderzoek: Biedt een mensrelevant systeem om in vitro bevindingen te koppelen aan in vivo neurotoxiciteitsresultaten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar, bankbaar neuraal differentiatieplatform dat toepasbaar is op meerdere therapeutische gebieden van het centrale zenuwstelsel.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door het gebruik van fysiologisch relevante menselijke neurale cellen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde EB-vorming, isolatie van rozetten en differentiatie-tijdlijnen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door neurotoxische risico's in een eerder stadium van de discovery-pipeline te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van menselijke neurale activiteitsprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, steriele technieken en microscopische manipulatie voor de dissectie van rozetten.
- Afhankelijk van matrix-gecoate oppervlakken en gedefinieerde inductiemedia voor een consistente vorming van neuro-epitheliale aggregaten.
- Vereist gestandaardiseerde celtelling en levensvatbaarheidsbeoordeling met trypaanblauw om de consistentie van de assay te waarborgen.
- Omvat handmatige behendigheid bij het verzamelen en dissociëren van fragmenten, wat de inter-operator variabiliteit kan beïnvloeden.
- Vertrouwt op getimede mediumverversingen en incubatiecondities om een synchrone differentiatie over de wells te bereiken.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format
Gerelateerde video's
0 Bekeken
De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026